一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系及其应用。本发明专利技术针对LAMP扩增产物设计互补的寡核苷酸探针，将烷巯基化的探针连接到纳米金颗粒上，制备特异性的SjR2纳米金探针，用于LAMP扩增产物的鉴定，进一步提高LAMP检测法的特异性和稳定性，建立了更加敏感特异和高效简便的适宜于疫区现场应用的血吸虫特异性DNA检测法，为我国血吸虫病消除战略提供新的技术手段。

Lamp detection system based on sjr2 nano gold probe and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系及其应用
本专利技术涉及一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系及其应用，属于检测

技术介绍
血吸虫病是世界上仅次于疟疾的第二大寄生虫病，流行于世界上74个国家和地区，主要集中于发展中国家。据最新文献资料统计，被血吸虫感染人数为3.91-5.97亿人，受感染威胁的人数达8亿人。我国主要流行日本血吸虫病，该病流行区分布于我国长江流域及其以南的江苏、浙江、安徽、江西、福建、上海、湖南、湖北、广东、广西、云南、四川等12个省、市、自治区。据2018年全国血吸虫病疫情通报，全国共有453个血吸虫病流行县，现有晚期血吸虫病病人约3万例。我国虽然在血吸虫病的防制工作中取得了世界瞩目的成就，但是我国的血防形势依然不容乐观。近年来，输入性血吸虫病的发病率呈现逐年升高的趋势，再加上局部地区疫情的明显回升以及已达标地区疫情尚不稳定，血吸虫病的传播风险在局部地区仍然较大，预示着我国的血防工仍然面临着严峻的考验。《“健康中国2030”规划纲要》提出，2030年全国要实现血吸虫病消除的目标，要达到这一目标，敏感、特异的血吸虫病诊断方法是血防工作中不可或缺的基石。然而，目前日本血吸虫病的确诊主要依据病原学检测，粪检法例如Kato-Katz法，仍是目前常用的确诊方法，但随着疫区病人感染率和感染度的逐年下降，粪检法检测的敏感性不断受到质疑。现有的大量研究资料均证实，粪检法受到虫体排卵波动性和粪便样本间差异的影响，一张Kato-Katz厚涂片法容易漏检低感染度病人，低估流行区真实的感染状态，影响考核疗效的准确性。此外，由于血吸虫的生活史的特殊性，粪检法需在病人感染后急性病变期才能检获虫卵，不具有早期诊断价值，且疫区居民对粪检法的依从性亦呈现逐年下降的趋势，更加凸显了粪检法的局限性，发展新的诊断方法显得尤为必要。免疫学诊断方法因其有较高的敏感性和较好的群众依从性，而受到重视并获得快速发展，在对疫区化疗对象的大规模筛查和血清流行病学调查以及防治效果的评价等方面发挥了重要作用，但是到目前为止仍然没有理想的血吸虫病早期诊断和疗效考核的方法。理论上检测血吸虫循环抗原能满足早期诊断及疗效考核的要求，但对慢性轻度感染者敏感性不高，治疗后不同时间的阴转率也不高。血吸虫循环抗体检测试验，由于抗体在化疗后很长时间内仍在体内保持一定的水平，通常维持在一年以上，且其在体内的水平和转归具有个体差异性，其定性检测结果不能区别现症感染和既往感染，疗效考核价值不理想，无法有效控制传染源，成为长期以来血吸虫病防治工作中亟待解决的难题。核酸检测技术的发展和应用为血吸虫病的早期诊断和疗效考核提供了新方法。就理论而言，检测日本血吸虫的特异性DNA片段与日本血吸虫的病原检测具有同样的确诊价值。并且核酸检测技术在特异性、敏感性和稳定性上具有免疫学诊断所无法比拟的优越性。但以粪便作为检测样本建立的PCR法，仍然存在与粪检法同样的局限性，无早期诊断价值，更不能准确评价化疗效果。血吸虫作为一种多细胞的寄生虫，其在宿主体内移行、发育、成熟的整个过程中亦会有大量的血吸虫游离DNA释放到外周血中，那么这部分游离DNA亦可以用来诊断血吸虫病。更为重要的是，与粪便样本不同，血吸虫游离DNA均匀分布于血清中，避免了随机取样带来的偏差，因此对血清样本DNA的检测更具有实际应用价值。目前国内外已有应用各种PCR法检测日本血吸虫、曼氏血吸虫以及埃及血吸虫特异性DNA的报道。然而，由于PCR法需要昂贵的实验仪器以及大量实验技术人员的支持，无法在经济落后、资源匮乏的农村地区广泛开展。日本学者Notomi等报道的环介导的恒温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)由于具有高效、快速、简便易操作、结果直观、适合于现场检测等优点而获得了快速发展，并用于多种病原微生物的检测。申请者课题组在之前的研究中针对日本血吸虫逆转录转座子SjR2建立了敏感、特异的LAMP检测方法，对日本血吸虫低感染度家兔模型(感染30条尾蚴)的检测结果显示，可于感染后3天检出血吸虫特异性DNA，并于治疗后10周检测结果转为阴性。虽然LAMP法有诸多优点，但仍需要进一步完善，集中体现在对扩增产物的观察和判断上。目前常用的产物鉴定方法有以下5种：(1)琼脂糖凝胶电泳法；(2)浊度观察法；(3)观察荧光法；(4)比色法；(5)胶纸条试纸检测法。琼脂糖凝胶电泳法由于在电泳过程中会形成大量气溶胶，容易污染实验环境而较少应用。浊度观察法和检测荧光法存在敏感性、特异性差的缺陷，不适合用于病原检测。本课题组在前期研究过程中发现LAMP检测体系存在的不足之处即对扩增产物鉴定存在不稳定因素，主要表现为：需要在扩增反应结束后加入荧光染料来判定检测结果，一方面增加了污染的风险，另一方面，由于SYBRGreenI是一种非特异性地嵌入到DNA双链中的染料，容易出现假阳性结果。近年来，由于纳米技术的渗透，尤其是纳米金探针(Au-nanoparticleprobe，AuNPprobe)的快速发展，使得比色法和胶纸条试纸检测法获得了快速发展，广泛应用于核酸扩增产物的检测，可提高检测的敏感性、特异性和稳定性，同时又降低了检测成本，更加适用于资源匮乏地区的现场检测。但是现有的用于检测日本血吸虫的纳米金探针LAMP检测体系还存在对扩增产物鉴定特异性和稳定性不足的缺陷。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系检测日本血吸虫DNA的方法。本专利技术针对LAMP扩增产物设计互补的寡核苷酸探针，将烷巯基化的探针连接到纳米金颗粒上，制备特异性的SjR2纳米金探针，用于LAMP扩增产物的鉴定，进一步提高LAMP检测法的特异性和稳定性。本专利技术的第一个目的是提供一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系，包括采用LAMP引物组合与纳米金连接制备纳米金探针，所述的LAMP引物组合包括4条LAMP引物，具体包括两条外引物SjR2F3和SjR2B3，两条内引物SjR2FIP和SjR2BIP，其中，SjR2F3：CTTCGTGTTTCCGGGGACSjR2B3：GGAGCATAGGCAGAGACAACSjR2FIP：CGAGGAGAGCCTGTTCAGCTTTTACCACTCGAGGCCTTGCSjR2BIP：AGACAGTCGATTGTGCGCTGTGAGACAACGGCGTGTGTC。进一步地，所述的LAMP引物组合通过巯基化的polyA片段与纳米金连接。进一步地，所述的polyA片段为10个A碱基。进一步地，LAMP检测体系具体包括以下检测组分：进一步地，所述的LAMP检测体系的反应条件为60～65℃保温30～90min。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测日本血吸虫DNA的引物组，所述的引物组包括4条LAMP引物，具体包括两条外引物SjR2F3和SjR2B3，两条内引物SjR2FIP和SjR2BIP，其中，SjR2F3：CTTCGTGTTTCCG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系，其特征在于，包括采用LAMP引物组合与纳米金连接制备纳米金探针，所述的LAMP引物组合包括4条LAMP引物，具体包括两条外引物SjR2F3和SjR2B3，两条内引物SjR2FIP和SjR2BIP，其中，/nSjR2F3：CTTCGTGTTTCCGGGGAC/nSjR2B3：GGAGCATAGGCAGAGACAAC/nSjR2FIP：CGAGGAGAGCCTGTTCAGCTTTTACCACTCGAGGCCTTGC/nSjR2BIP：AGACAGTCGATTGTGCGCTGTGAGACAACGGCGTGTGTC。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系，其特征在于，包括采用LAMP引物组合与纳米金连接制备纳米金探针，所述的LAMP引物组合包括4条LAMP引物，具体包括两条外引物SjR2F3和SjR2B3，两条内引物SjR2FIP和SjR2BIP，其中，
SjR2F3：CTTCGTGTTTCCGGGGAC
SjR2B3：GGAGCATAGGCAGAGACAAC
SjR2FIP：CGAGGAGAGCCTGTTCAGCTTTTACCACTCGAGGCCTTGC
SjR2BIP：AGACAGTCGATTGTGCGCTGTGAGACAACGGCGTGTGTC。


2.根据权利要求1所述的基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系，其特征在于，所述的LAMP引物组合通过巯基化的polyA片段与纳米金连接。


3.根据权利要求2所述的基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系，其特征在于，所述的polyA片段为10个A碱基。


4.根据权利要求1所述的基于SjR2纳米金探针的LAMP检测体系，其特征在于，LAMP检...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏超明，许静，李春香，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32