一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法技术

一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法，含有12种常见寄主动物COI基因的扩增引物，通过提取吸血蠓饱血腹部的血液基因组DNA，采用不同引物进行PCR扩增，再根据扩增产物大小鉴定出相应的寄主。本申请提供扩增12种常见寄主动物COI基因的扩增引物及寄主鉴定方法，有利于实现吸血蠓常见寄主的快速、准确鉴定，降低物种鉴定成本。

A host identification method of bloodsucking midges based on COI gene of species

【技术实现步骤摘要】
一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法
本专利技术涉及一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法，属于吸血蠓类寄主动物的物种鉴定领域。
技术介绍
蠓科Ceratopogonidae昆虫隶属于双翅目Diptera长角亚目Nematocera，是长角亚目中最大的一个类群，我国现知39属1015种。吸血蠓（Bloodsuckingmidges）是蠓科昆虫中能叮咬人和动物并吸食其血液的类群的总称，目前全世界共有4属1487种，广泛分布于世界各地。迄今，我国已知三大吸血蠓属，即库蠓属Culicoides、蠛蠓属Lasiohelea及细蠓属Leptoconops。吸血蠓体型微小，可直接侵袭人和动物，在吸食血液过程中会造成人或动物真皮层机械损伤，类似于蚋科、虻科、沙蝇科等其他吸血昆虫。当吸血蠓吸食到受病毒感染的宿主后，其唾液中也含有病毒性病原体，包括流行性出血热病毒（EHDV）、蓝舌病毒（BTV）、Schmallenberg病毒（SBV）等。吸血蠓作为虫媒病毒的重要载体，可对人和动物造成一定的危险性，严重时可造成疾病的大规模流行，带来巨大的经济损失。因此，吸血蠓在医学研究及疾病传播领域中具有不可忽视的地位，而媒介控制是蠓媒传染病防治的主要措施之一，准确鉴定吸血蠓类昆虫的寄主偏好，掌握传播媒介吸血习性是对蠓传疾病进行监测、防治的关键。目前，检测吸血蠓寄主的方法主要有两种，分别是免疫法和分子测序法。免疫法是利用相应寄主的抗原或抗体与吸血蠓腹部血粉进行反应来鉴定吸血蠓的寄主，但此类方法具有步骤繁琐、试剂昂贵等缺陷。分子测序法是利用通用引物对不同动物的特定基因序列进行PCR扩增，测序后经过数据库比对来鉴定吸血蠓的寄主，此方法虽准确，但测序成本较高。因此，需寻求一种快速、简便、准确且检测成本较低的方法，以弥补以往检测方法的不足。随着分子生物学的发展，分子检测技术也有了进一步的提升。COI基因是线粒体基因组中的一个基因，是目前应用较多的分子标记。该基因与线粒体其他基因相比，具有较为保守的结构和大小，包含大量的遗传信息，并且在物种内不同个体之间只有1%-2%的差异，而在不同物种之间差异较大。迄今为止，COI基因已用于大多数生物类群的分子鉴定，故选用该基因对吸血蠓寄主进行分子鉴定。本专利技术提供了12种寄主生物（人，牛，羊，鸭，狗，猪，鼠，马，兔，猫，鹿以及鸡）的COI基因特异引物及寄主鉴定方法，有利于实现对上述寄主的快速、准确鉴定，缩短鉴定时间，降低物种鉴定成本。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法。通过提取吸血蠓腹部血粉DNA，利用不同物种的特异引物PCR扩增其COI基因，比对PCR产物条带大小，实现吸血蠓寄主准确且快速的鉴定。为实现上述目标，所采用的技术方案如下：一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法，含有12种常见寄主动物COI基因的特异性扩增引物，引物序列及其扩增片段长度如下：a、人的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAATACCAAACGCCCCTCTTC3’；下游引物：5’AGGTTTATGGAGGGTTCTTCTAC3’；扩增片段长度为：944bp；b、牛的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TGAATTAGGCCAACCCGGAA3’；下游引物：5’GTCGACGTCTATTCCGACAGT3’；扩增片段长度为：784bp；C、羊的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAACCCGGAACCCTACTTGG3’；下游引物：5’ATGCCTGCTAGGTGTAGGGA3’；扩增片段长度为：338bp；d、鸭的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCCGACATAGCATTCCCACG3’；下游引物：5’CGTGTAGGGTGGCGAGTCAG3’；扩增片段长度为：718bp；e、狗的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACTAGGTCAGCCCGGTACTT3’；下游引物：5’CAGTGGGCAAATCCTCCCAT3’；扩增片段长度为：1068bp；f、猪的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCACCCGCAATACTATGAGCTCTG3’；下游引物：5’TGATAGGGAGGAGGACATCCG3’；扩增片段长度为：506bp；g、鼠的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCTAGCCGCAGGCATTACTA3’；下游引物：5’TGGGTGCCCAAAGAATCAGA3’；扩增片段长度为：121bp；h、马的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACCACAAAGACATCGGCACT3’；下游引物：5’AATCGAGGACACCCCAGCTA3’；扩增片段长度为：443bp；i、兔的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAGGAGGAGGAGACCCTAT3’；下游引物：5’TAGTCTGAGTACCGTCGGGG3’；扩增片段长度为：662bp；j、猫的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GGGCCAACCTGGTACACTAC3’；下游引物：5’ATTCCGGACAGGCCTAGGAA3’；扩增片段长度为：1185bp；k、鹿的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TACAGTCGGAGGCTTAACCG3’；下游引物：5’GGATGCAAACGCTTCTCAG3’；扩增片段长度为：391bp；l、鸡的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CTTCGGTCACCCCGAAGTTT3’；下游引物：5’CCAGTTGGGATGGCGATGAT3’；扩增片段长度为：240bp；所述鉴定方法包括以下步骤：步骤1：将吸血蠓饱血腹部内容物分离出来，用于提取基因组DNA；步骤2：以基因组DNA为模板，分别加入12种常见寄主动物COI基因的特异性扩增引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下；2×EsTaqMasterMix4.5μL；引物p1（100pmol/L）0.2μL；引物p2（100pmol/L）0.2μL；模板DNA1μL；ddH2O6.6μL；总体积12.5μL；反应条件为：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，牛、羊、人53℃，鸭、鼠、鹿54℃，狗、马、兔、猫、鸡55℃，猪56℃，退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；最后16℃，保存；步骤3：取出一定量的PCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离，与DNAMarker电泳条带进行比对判断出扩增条带的大小，即人944bp、牛784bp、羊338bp、鸭718bp、狗1068bp、猪506bp、鼠121bp、马443bp、兔662bp、猫1185bp、鹿391bp、鸡240bp；步骤4：最后，根据PCR扩增产物与Marker电泳条带的对比结果，即可判断待测的蠓虫腹部血粉属于哪一物种即对应的寄主。...

【技术保护点】
1.一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法，含有12种常见寄主动物COI基因的特异性扩增引物，引物序列及其扩增片段长度如下：/na、人的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAATACCAAACGCCCCTCTTC 3’；下游引物：5’ AGGTTTATGGAGGGTTCTTCTAC 3’； 扩增片段长度为：944bp；/nb、牛的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ TGAATTAGGCCAACCCGGAA 3’；下游引物：5’ GTCGACGTCTATTCCGACAGT 3’； 扩增片段长度为：784 bp；/nC、羊的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ CAACCCGGAACCCTACTTGG 3’；下游引物：5’ ATGCCTGCTAGGTGTAGGGA 3’； 扩增片段长度为：338bp；/nd、鸭的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ CCCGACATAGCATTCCCACG 3’；下游引物：5’ CGTGTAGGGTGGCGAGTCAG 3’ ；扩增片段长度为：718bp；/ne、狗的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACTAGGTCAGCCCGGTACTT 3’； 下游引物：5’ CAGTGGGCAAATCCTCCCAT 3’； 扩增片段长度为：1068 bp；/nf、猪的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCACCCGCAATACTATGAGCTCTG 3’； 下游引物：5’ TGATAGGGAGGAGGACATCCG 3’； 扩增片段长度为：506bp；/ng、鼠的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ GCTAGCCGCAGGCATTACTA 3’； 下游引物：5’ TGGGTGCCCAAAGAATCAGA 3’； 扩增片段长度为：121bp；/nh、马的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ ACCACAAAGACATCGGCACT 3’； 下游引物：5’ AATCGAGGACACCCCAGCTA 3’； 扩增片段长度为：443bp；/ni、兔的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ GCAGGAGGAGGAGACCCTAT 3’； 下游引物：5’ TAGTCTGAGTACCGTCGGGG 3’； 扩增片段长度为：662bp；/nj、猫的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ GGGCCAACCTGGTACACTAC 3’； 下游引物：5’ ATTCCGGACAGGCCTAGGAA 3’； 扩增片段长度为：1185bp；/nk、鹿的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ TACAGTCGGAGGCTTAACCG 3’； 下游引物：5’ GGATGCAAACGCTTCTCAG 3’； 扩增片段长度为：391bp；/nl、鸡的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ CTTCGGTCACCCCGAAGTTT 3’； 下游引物：5’ CCAGTTGGGATGGCGATGAT 3’； 扩增片段长度为：240bp；/n所述鉴定方法包括以下步骤：/n步骤1：将吸血蠓饱血腹部内容物分离出来，用于提取基因组DNA；/n步骤2：以基因组DNA为模板，分别加入12种常见寄主动物COI基因的特异性扩增引物进行PCR扩增， PCR反应体系如下；/n2×Es Taq MasterMix 4.5 μL；/n引物p1（100 pmol/L） 0.2 μL；/n引物p2（100 pmol/L） 0.2 μL；/n模板DNA 1 μL；/nddH...

【技术特征摘要】
1.一种基于物种COI基因的吸血蠓寄主鉴定方法，含有12种常见寄主动物COI基因的特异性扩增引物，引物序列及其扩增片段长度如下：
a、人的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAATACCAAACGCCCCTCTTC3’；下游引物：5’AGGTTTATGGAGGGTTCTTCTAC3’；扩增片段长度为：944bp；
b、牛的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TGAATTAGGCCAACCCGGAA3’；下游引物：5’GTCGACGTCTATTCCGACAGT3’；扩增片段长度为：784bp；
C、羊的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CAACCCGGAACCCTACTTGG3’；下游引物：5’ATGCCTGCTAGGTGTAGGGA3’；扩增片段长度为：338bp；
d、鸭的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’CCCGACATAGCATTCCCACG3’；下游引物：5’CGTGTAGGGTGGCGAGTCAG3’；扩增片段长度为：718bp；
e、狗的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACTAGGTCAGCCCGGTACTT3’；下游引物：5’CAGTGGGCAAATCCTCCCAT3’；扩增片段长度为：1068bp；
f、猪的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’TCACCCGCAATACTATGAGCTCTG3’；下游引物：5’TGATAGGGAGGAGGACATCCG3’；扩增片段长度为：506bp；
g、鼠的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCTAGCCGCAGGCATTACTA3’；下游引物：5’TGGGTGCCCAAAGAATCAGA3’；扩增片段长度为：121bp；
h、马的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’ACCACAAAGACATCGGCACT3’；下游引物：5’AATCGAGGACACCCCAGCTA3’；扩增片段长度为：443bp；
i、兔的COI基因的特异性扩增引物，上游引物：5’GCAGGAGGAGGAGACCCTAT3’；下游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢雪，侯晓晖，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52