检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法，属于分子生物技术领域。检测树鼩LCN2基因转录水平的引物包括树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物。本发明专利技术以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用上述引物进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量LCN2基因转录水平。应用本发明专利技术所公开的引物序列可实现对树鼩GAPDH基因及LCN2基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明专利技术的引物可对树鼩LCN2基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。

Primers, kits and methods for detection of Lcn2 gene transcription in tree shrews

【技术实现步骤摘要】
检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法，尤其涉及一种非诊断目的的用实时荧光定量RT-qPCR法检测树鼩LCN2基因转录水平的方法。
技术介绍
LCN2(人脂质运载蛋白2)又称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是急性肾损伤的标志物，肾小管上皮细胞、中性粒细胞、肺泡巨噬细胞会少量分泌中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。参与炎症免疫应答，肾脏间质细胞向上皮细胞转化过程受输尿管芽分泌因子的调控，能实时监控肾损伤的发展过程，使诊断更具有特异性和敏感性。LCN2是BAT(棕色脂肪组织）活化的关键调节剂。它的缺乏导致体重增加，并损害适应性生热作用。LCN2上调UCP1(解偶联蛋白1)的表达，它介导BAT的产热活性。值得注意的是，最初从嗜中性粒细胞中分离出来的LCN2与肥胖和脂肪细胞炎症有关，因为核因子-κB（NF-κB）可以激活其表达。此外，LCN2被认为是一种铁结合蛋白，可以诱导氧化应激。LCN2介导炎症和氧化应激的调节中起重要作用。目前对LCN2基因的研究主要集中在其蛋白功能及对蛋白的检测分析上，对其转录水平的研究可以更深入的了解作用机制和调控机制。为研究树鼩体内LCN2的转录水平，需建立一种能够精确对LCN2mRNA定量检测的方法，为LCN2的进一步研究打下基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法，以在转录水平上对LCN2基因进行定量检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：检测树鼩LCN2基因转录水平的引物，包括树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；其中，树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：LCN2F：5＇-ggaagtggtacaccgtaggc-3＇；LCN2R：5＇-gtagctgccgtcttcgttca-3＇；作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物序列如下：GAPDHF：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；GAPDHR：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。本专利技术同时提供含有上述检测树鼩LCN2基因转录水平的引物的试剂盒。本专利技术还提供上述引物或试剂盒在非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的应用。本专利技术另外提供用于非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的方法，包括如下步骤：步骤（1），分别以健康和待测树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；步骤（2），建立树鼩GAPDH基因及LCN2基因标准曲线：以Easydilution梯度稀释步骤（1）得到的健康树鼩肾脏组织cDNA第一链，分别以未稀释cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，并分别以LCN2F和LCN2R、GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，分别得到健康树鼩GAPDH基因、LCN2基因的溶解曲线和扩增曲线；之后以起始模板量拷贝数Log10的对数值为X轴，以Cq值为Y轴进行绘制，分别得到GAPDH基因、LCN2基因的标准曲线；步骤（3），将步骤（1）得到的待测树鼩肾脏组织cDNA第一链分别以LCN2F和LCN2R、GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，扩增体系和扩增程序与步骤（2）相同，分别得到待测树鼩GAPDH基因、LCN2基因的溶解曲线和扩增曲线；之后根据步骤（2）得到的标准曲线进行计算，得到树鼩LCN2基因转录水平。基于实时荧光定量检测的原理，即每个模板的Cq值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：Cq=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)（n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。）起始拷贝数越多，Cq值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Cq值。因此，获得未知样品的Cq值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。所以根据步骤（2）得到的标准曲线和每个样品的Cq值，利用Bio-RadCFXManager3.1软件中自带的基因表达计算功能就能得到树鼩LCN2基因转录水平。进一步，优选的是，以Easydilution梯度稀释步骤（1）树鼩肾脏组织cDNA第一链，梯度稀释倍数分别为5倍、25倍、125倍、625倍。进一步，优选的是，实时荧光定量PCR扩增体系下：SYBRPremixExTaqII(2x)5μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板0.8μL，去离子水3.4μL，总计10μL，上、下游引物浓度均为10μM。进一步，优选的是，实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s、60℃退火30s、40个循环。在检测时，当溶解曲线上峰不唯一时，则说明实验中存在污染，需要重新进行检测。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术适用于实时荧光定量PCR检测。应用本专利技术所公开的引物序列可实现对树鼩GAPDH基因及LCN2基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本专利技术的引物可对树鼩LCN2基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。本专利技术为研究树鼩LCN2基因的功能及影响因素提供了有效工具。附图说明图1为树鼩GAPDH基因的扩增曲线；图2为树鼩GAPDH基因的标准曲线；图3为树鼩LCN2基因的扩增曲线；图4为树鼩LCN2基因的标准曲线；图5为树鼩GAPDH基因的表达扩增曲线；图6为树鼩GAPDH基因的表达熔解峰；图7为树鼩LCN2基因的表达扩增曲线；图8为树鼩LCN2基因的表达熔解峰；图9为树鼩LCN2基因的表达相对表达；图10为树鼩LCN2基因肾脏扩增产物胶图；M：maker；1和2为两只不同的树鼩扩增产物胶图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。1、本实施例中所使用的实验动物：树鼩，雌性9只，雄性10只。2、实验动物的分组及给药：将做过空白血清检测的19只树鼩取出1只雄性树鼩待取肾脏组织做标准曲线，剩余18只树鼩随机分成对照本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测树鼩LCN2基因转录水平的引物，其特征在于，包括树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；/n其中，树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：/nLCN2 F：5＇-ggaagtggtacaccgtaggc-3＇；/nLCN2 R：5＇-gtagctgccgtcttcgttca-3＇；/n作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物序列如下：/nGAPDH F：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；/nGAPDH R：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。/n

【技术特征摘要】
1.检测树鼩LCN2基因转录水平的引物，其特征在于，包括树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；
其中，树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：
LCN2F：5＇-ggaagtggtacaccgtaggc-3＇；
LCN2R：5＇-gtagctgccgtcttcgttca-3＇；
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物序列如下：
GAPDHF：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；
GAPDHR：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。


2.含有权利要求1所述检测树鼩LCN2基因转录水平的引物的试剂盒。


3.权利要求1所述的引物、权利要求2所述的试剂盒在非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的应用。


4.用于非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），分别以健康和待测树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
步骤（2），建立树鼩GAPDH基因及LCN2基因标准曲线：以Easydilution梯度稀释步骤（1）得到的健康树鼩肾脏组织cDNA第一链，分别以未稀释cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，并分别以LCN2F和LCN2R、GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：王陈芸，唐东红，叶尤松，李哲丽，李涛，徐瑾，董鑫，张铭娟，黄明峰，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53