用于底板中脑多巴胺能祖细胞的单细胞蛋白质表达谱分析的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于分析包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物的体外方法，所述方法包括：a)使所述细胞组合物的细胞或其样品的细胞接触对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子，由此标记所述细胞组合物或所述样品的细胞；b)测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，并且其中如果所述细胞组合物的细胞的蛋白质表达谱是如下，则所述细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞：80‑100％的所述细胞呈FOXA2阳性，80‑100％的所述细胞呈OTX2阳性，小于10％的所述细胞呈PAX6阳性，并且小于10％的所述细胞呈NKX6.1阳性。还提供了用于所述方法的包括所述抗原结合分子的试剂盒。

A method of single cell protein expression profiling for dopaminergic progenitor cells in the midbrain

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于底板中脑多巴胺能祖细胞的单细胞蛋白质表达谱分析的方法产生本专利技术的工作已从EuropeanUnionSeventhFrameworkProgrammeFP7/2007-2013在拨款方案No.602278下获得资金。
本专利技术涉及用于在单细胞水平上分析人底板(floorplate)中脑多巴胺能祖细胞的蛋白质表达谱(expressionprofile)的方法。
技术介绍
中脑多巴胺能(DA)神经元分泌神经递质多巴胺，在不同的大脑功能(例如认知，记忆处理，运动控制和运动)中发挥中枢作用。它们是在三种不同的细胞核中发现：黑质致密部(substantianigraparscompacta)(A9组)，腹侧被盖区(ventraltegmentalarea)(A10组)和脑红核后区域(retrorubralfield)(A8组)。中脑的黑质致密部(SNpc)中的A9组的细胞体使尾壳核(caudateputamen)、背侧纹状体(dorsalateralstriatum)受神经支配，并形成黑质纹状体通路，其通过从突出多巴胺能神经元控制释放多巴胺而调节运动功能。A9多巴胺能神经元在黑质中的变性是多巴胺系统的功能障碍和描述为紊乱帕金森氏病(PD)的多种运动特征的主要原因。虽然PD还涉及其他神经元亚型的变形，但是黑质致密部多巴胺能神经元的丧失是PD症状的主要原因，并已成为细胞替代治疗的主要目标。在胎儿发育过程中，这些DA神经元的祖细胞在发育中的中脑的腹侧神经管中形成。来自所谓的底板区域的祖细胞的特征在于转录因子FOXA2，LMX1A和OTX2的表达。这些细胞产生DASNpc神经元(A9组)和DA腹侧被盖区神经元(A10组)。已表明，从胎儿中脑中解剖出并被移植到帕金森病患者的纹状体中的胎儿细胞，可以在功能上使纹状体重新受神经支配并恢复多巴胺能神经元的功能(Barker，2013；Kefalopoulou，2014)。但是，胎儿DA祖细胞有限的可得性和使用这种组织的伦理以及后勤顾虑强调了替代细胞来源的必要性。在过去的几年中，确定了对多能干细胞(PSC)或诱导性多能干细胞(iPSC)成功分化为腹侧中脑(mes)多巴胺能(DA)祖细胞至关重要的因素，并导致了用于产生治疗相关的mesDA神经元的体外分化方案的各种方案(Kriks，2011；Kirkeby，2012；Kirkeby，2013；Grealish，2014；Kirkeby，2017)，这是PD背景下用于临床应用的最有希望的细胞群，因为它类似于交配后(postcoitum)第6-7.5周人胚胎的腹侧中脑的更复杂组成(EP3061809)。不同的研究表明，从胚胎干细胞分化的mesDA祖细胞在以下方面具有与衍生自人胎儿腹侧中脑的细胞相同的特征：i)亚型特异性成熟；ii)大鼠帕金森模型中的整合和投射能力；iii)经调节的DA释放；和iv)帕金森症状的功能恢复(Grealish，2014；Kirkeby，2012)。方案是基于通过化学抑制糖原合酶激酶3(GSK3)以诱导WNT信号传导用于尾状模式化(caudalisedpatterning)为中脑命运和激活声波刺猬(SHH)信号传导用于模式化为腹侧命运而对神经转化和区域化的双重SMAD抑制(Kirkeby，2013)。尽管为产生多巴胺能神经元祖细胞优化了方案，但制造的细胞批次中的差异仍不可避免。已知体外分化的细胞培养物可含有具有不想要的细胞命运或分化阶段的细胞，因为分化过程是高度复杂且敏感的程序，其中实验结果可受到轻微变化的影响(例如，取决于用户的操作变化，细胞密度，分化开始之前的起始细胞组合物中的变化，例如细胞系、传代数和培养条件，和生长因子效价)。因此，在GMP级PSC/iPSC衍生mesDA神经元的产生内的一种需要是用于全面细胞产物表征的可靠体外测定方法的建立，其允许确定细胞批次的身份和纯度。而且，该测定方法必须与细胞植入并成熟为中脑多巴胺能神经元的潜力相关联，以及揭示潜在的致瘤性。通常将中脑底板标记物(如LMX1A，FOXA2和OTX2)用于在植入之前确认细胞的身份。最近，Kirkeby等确定了一组体外标记物，其允许通过qRT-PCR预测成功的细胞植入(Kirkeby等，2017)。除了LMX1A，FOXA2和OTX2以外，成功植入结果的预测标志物为EN1，ETV5，CNPY1，PAX8和SPRY1。而且，间脑区域标志物，如EPHA3，FEZF1和WNT7B与负相关的植入结果相关。然而，在mRNA水平上对大量细胞分析了表达。这具有几个缺点。首先，公知基因的mRNA表达水平仅反映其表达为蛋白质或作为蛋白质存在的潜力。基于众多转录后调控机制、翻译后修饰以及蛋白质和mRNA的不同稳定性和流动率，mRNA到实际蛋白质的转换可或不可发生，且如果其发生，其可导致众多不同的、略有变化的形式的给定蛋白质。而且，尽管在给定时刻可能无法检测到基因的mRNA，但相应的蛋白质仍可以存在数周或甚至数月。因此，不可能通过阳性或阴性地检测相应的mRNA来不可改变地预测某种形式的蛋白质的存在。重要的是，在免除调节性RNA和核酶的情况下，只有蛋白质而不是其相应的mRNA发挥影响细胞状态及其环境的功能。其次，对大量细胞的测量不反映单个细胞的真实状态，而是生成水平化的结果，其甚至可能不在单个细胞中存在。但是，由于给定混合物中只有一部分细胞可能是感兴趣的或有危险的细胞，因此主体分析不具有允许真实且定量地描述细胞混合物中不同表型的细胞的灵敏度和区分能力。另外，使用基于PCR的技术的方法是费时且易受污染的。总之，需要允许在单个细胞的蛋白水平上的定量读出，并且预测底板mesDA祖细胞在移植到受试者之后的成功细胞处理和植入的方法。
技术实现思路
本专利技术描述了一种新用户友好的标准化方法，用于底板mesDA祖细胞在单细胞水平上的蛋白质谱分析，其也可以在GMP条件下使用。预料不到地，我们发现了在蛋白质水平上允许清楚地描述细胞表型的标记物组合。对阳性和阴性底板mesDA祖细胞标记物具有特异性的抗原结合分子如抗体-荧光染料缀合物用于例如流式细胞术，其第一次允许分化的底板mesDA祖细胞在大约2.5小时内的单细胞、定量、标准化蛋白质谱分析，用于识别细胞产物的身份。该组由抗原结合分子组成，例如对本文公开的mesDA神经元的一些或全部阳性和阴性标记物具有特异性的单克隆抗体克隆(阳性标记物：FOXA2，OTX2，CD47，NKX2.1；阴性标记物：OCT3/4，PAX6，SOX1，NKX6.1，KI-67)。对一些或所有这些细胞标记物为阳性或阴性的细胞的百分比描绘了细胞表型和纯度的清晰图画。我们进一步发现，在中脑的基板中以及在发育中的胚胎的后脑中表达的标记物NKX6.1是令人惊讶地有效的标记物，用于检测分化的干细胞群体中的后脑祖细胞的存在。因此，NKX6.1用作阴性标记物以将侧中脑和后脑细胞与中脑底板模式化细胞区分开。此外，令人惊讶地，我们发现，与PCR相比，通过流式细胞术在蛋白质水平评估时，标记物NKX2.1不同地表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分析包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物的体外方法，所述方法包括：/na)使所述细胞组合物的细胞或其样品的细胞接触对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子，由此标记所述细胞组合物或所述样品的细胞；/nb)测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，其中如果所述细胞组合物的细胞的蛋白质表达谱是如下，则所述细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞：/n80-100％的所述细胞呈FOXA2阳性，/n80-100％的所述细胞呈OTX2阳性，/n小于10％的所述细胞呈PAX6阳性，并且/n小于10％的所述细胞呈NKX6.1阳性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170717 EP 17181588.91.一种用于分析包含人底板mesDA祖细胞的细胞组合物的体外方法，所述方法包括：
a)使所述细胞组合物的细胞或其样品的细胞接触对抗原FOXA2，OTX2，PAX6，和NKX6.1具有特异性的抗原结合分子，由此标记所述细胞组合物或所述样品的细胞；
b)测定被所述抗原各自的所述抗原结合分子标记的所述细胞的百分比，其中如果所述细胞组合物的细胞的蛋白质表达谱是如下，则所述细胞有资格作为人底板mesDA祖细胞：
80-100％的所述细胞呈FOXA2阳性，
80-100％的所述细胞呈OTX2阳性，
小于10％的所述细胞呈PAX6阳性，并且
小于10％的所述细胞呈NKX6.1阳性。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中，如果所述细胞衍生自OCT3/4阳性细胞，则使所述细胞另外与对抗原OCT3/4具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
小于0.1％的所述细胞呈OCT3/4阳性。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中，所述细胞另外与对抗原NKX2.1具有特异性的抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
5-90％的所述细胞呈NKX2.1阳性。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，使所述细胞另外与对选自抗原KI-67，IAP和SOX1的抗原具有特异性的至少一种抗原结合分子接触，并且其中在步骤b)中，所述细胞的所述蛋白质表达谱另外包括：
如果在步骤a)中使用了对KI-67具有特异性的抗原结合分子，则10-90％的所述细胞呈KI-67阳性，
如果在步骤a)中使用了对IAP具有特...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·容布卢特，A·博西奥，S·克内贝尔，A·基尔克比，M·帕尔马尔，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE