在外周血中循环的上皮细胞的分离制造技术

本发明专利技术提供了一种识别在外周血中循环的上皮细胞的方法，该方法允许将患有表现出上皮细胞破坏的疾病的个体与不患有表现出上皮细胞破坏的疾病的个体区分开来。本发明专利技术还涉及用于实施本发明专利技术方法的试剂盒或设备。

Isolation of circulating epithelial cells in peripheral blood

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在外周血中循环的上皮细胞的分离
本专利技术属于医学领域，更具体的，本专利技术涉及一种识别在外周血中循环的上皮细胞的方法，该方法允许将患有表现出上皮细胞破坏性疾病的个体与没有患有这种疾病的个体区别开来，以及用于实施本专利技术方法的试剂盒或设备。
技术介绍
上皮是由紧密相连的细胞组成的组织，细胞间质较少。上皮细胞来源于两种胚胎生殖层：外胚层和内胚层，在结构上构成了大部分的器官。内胚层衍生出表皮和角膜的上皮细胞。腺部件，如汗腺、皮脂腺和乳腺。内胚层衍生出覆盖消化管的组织，也起源于内胚层。所有与消化器官相连的腺体，如肝、胰腺和胃以及肠的腺体。中胚层提供起源给肝脏、男性和女性的生殖器官。上皮细胞的一个基本特性是，它们倾向于在彼此之间保持非常大的接触，形成覆盖表面和填充空腔的连贯层。呼吸道上皮有双重起源，即喉部、气管、支气管和肺泡的上皮细胞由内胚层起源，而软骨、肌肉结构和血管系统由中胚层起源。上皮细胞，尤其是那些覆盖身体外表面和肠的上皮细胞，经常受到机械性创伤和其他类型的创伤。在生理条件下，这些上皮细胞不断死亡，然后被释放出来。在胃肠道中，细胞在绒毛上不断地脱落。相反的，在呼吸道，特别是在大多数腺体中，上皮细胞很少退化，因此，细胞的寿命相当长。生理学上带来的上皮细胞损失可以由相应的再生补偿，而在脊椎动物中，再生是通过相应的未分化细胞的有丝分裂增殖来产生的。在肺组织中，肺泡巨噬细胞负责吞噬和清除退化的肺组织，包括I型和II型肺泡壁细胞和表面活性物质。当巨噬细胞由于其特性不能消化这些颗粒时，颗粒就会在巨噬细胞的吞噬体中随着巨噬细胞迁移，直到粘液纤毛运输开始，在它们流动起来直到口咽后，与痰一起脱粘或清除。COPD(慢性阻塞性肺疾病)是全球范围内患病率和死亡率最高的呼吸系统疾病之一。它是仅次于心血管疾病和癌症的第三大死亡因素，并且发达国家近10％的成年人受其影响。此外，很大比例的患者的疾病没有被诊断出或没有得到适当的治疗。超过70％的患者没有意识到自己患有这种疾病，其中，许多人直到疾病发展到晚期才被诊断出来。COPD的特征是由于暴露在烟草烟雾中而导致肺功能逐渐丧失，这是炎症和免疫过程的生理转化，导致肺泡单位的破坏，小口径气道的损伤和支气管周围纤维化的疾病特征。由于这些过程，肺实质降解的残留物作为细胞外基质的成分被释放到全身循环中。COPD造成的肺功能丧失在不同患者之间可能存在差异，儿童期改变肺成熟的过程可能明显地倾向于疾病的发展。然而，加速检测失去肺功能的患者是不可行的，他们没有特定的肺病变过程的生物标记物。近年来，我们看到了一些技术的发展，这些技术允许在外周血中识别来自人体组织的细胞，并将其归类为液体活组织检查，并在肿瘤学领域证明了诊断的实用性。特别有趣的是，液体活组织检查在监测肺癌患者方面取得了进展，增加了预后信息，并允许对这些患者进行个性化治疗。理解了COPD的发病机制后，肺泡细胞或其残留物可能被排放到血液中，并可在肿瘤细胞中被识别。目前，COPD的诊断基本上是基于临床表现(咳嗽、咳痰、呼吸困难)和肺功能测试，主要是肺活量测定(使用支气管扩张剂后FEV1<0.7)。在这两种情况下，都与附带现象，临床症状和支气管阻塞有关，这些都是发生在疾病的生理病理已经改变后，没有任何可以用于早期诊断的标志物，直到它变得不可逆转，就像大多数确诊的COPD病例一样。西班牙COPD患者的平均年直接费用在910欧元到2060欧元之间。拥有一种诊断方法，能够及早发现患有该疾病的个人，或发现该疾病的高患病风险个人，提高当前程序的敏感性和特异性，可以降低经济成本并且改善专利的预后诊断。
技术实现思路
本专利技术的作者测定了第一种检测循环肺细胞(CPCs)技术的在体外的敏感性和特异性，并证明了在COPD患者外周血中分离CPCs是可能的。尽管，到目前为止，没有发现证据表明在血流中存在分化良好型的上皮细胞，但它们的存在暗示存在强烈的组织侵袭过程，超出了巨噬细胞消除“废物”的能力，以及其他生理机制，这在上皮组织(如肺和腺结构)中是特别重要的事实。因此，本专利技术中公开的技术，首次成功地检测出在外周血中的分化良好型的上皮细胞的存在，可以用于患有慢性阻塞性肺病的个体的诊断，以及对于任何表现为组织破坏和上皮细胞的释放的疾病的诊断。附图说明图1.血液中渗入的H820细胞和COPD患者的CPC的免疫荧光表征和细胞形态学表征。其中，列显示了(蓝色)4',6-二脒基-2-苯基吲哚，用于染色核酸(核)的染料(DAPI)、细胞角蛋白-FITC表达(绿色)、CD44v6-Alexa633紫色(红紫色)表达、(灰色)显示明场和合并通道后的信号。第一行表示从富集实验中分离的H820肺癌细胞，具有细胞角蛋白和CD44v6的阳性表达。第二、第三行表示从COPD患者中分离出的CPC，具有细胞角蛋白和CD44v6阳性信号。图2.基于从血液样本中分离出的CPC的存在，研究参与者的COPD特征。a)肺功能值(表示为预测值的％)。b)上一年的年化恶化率。c)CAT分数(COPD评估测试)。d)肺功能下降(表示为年化FEV1的下降(毫升/年))。条形表示平均值和SEM值。CPC+：分离出的CPC；CPC-：不是分离出的CPC。图3.BODEx指数的差异，取决于血液样本中分离出的CPC的存在。条形代表平均值和SEM。*＝p＜0.05。CPC+：分离出的CPC；CPC-：不是分离出的CPC。图4.非肿瘤肺组织的肺细胞的免疫荧光和组织形态学表征。列显示(蓝色)4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，用于染色核酸(核)的染料(DAPI)，CD44v6-FITC表达(绿色)，显示明场(灰色)和合并通道的信号。行表示气胸患者的肺组织。具体实施方式退化的上皮细胞具有消除的生理机制，主要通过巨噬细胞的吞噬作用。因此，在肺组织中，肺泡巨噬细胞负责吞噬和清除退化的肺组织，包括I型和II型肺泡壁细胞和表面活性物质。由于其性质，颗粒无法被巨噬细胞消化时，颗粒就会在巨噬细胞的吞噬体中随着巨噬细胞迁移，直到粘液纤毛运输开始，在它们流动起来直到口咽后，与痰一起脱粘或清除。因此，可能引起循环上皮细胞存在的疾病是那些影响肝、胰腺、肠、胃和肠腺以及生殖器官的疾病。本专利技术公开了一种检测上皮细胞的方法，该方法令人惊讶地可以在血液中检测上皮细胞。具体地，本专利技术的方法公开了一种从上皮组织中分离、检测以及表型和基因表征细胞的自动化方法，并且可以在血液中对其进行检测。外周血中所述细胞的检测是由会引起破坏现象和组织破坏的生理病理过程的存在决定的，例如，但不限于慢性阻塞性肺疾病(COPD)或存在肿瘤疾病。因此，在第一种情况下，我们可以谈论循环肺细胞(CPCs)，在第二种情况下，我们可以谈论循环肿瘤细胞(CTCs)。肿瘤细胞远程产生转移的能力是众所周知的，并且许多临床研究和基础研究集中在其检测和表征上。然而，迄今为止，在血流中尚未检测到循环上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于识别个体在外周血中循环的非肿瘤上皮细胞的方法，包括以下步骤：根据循环上皮细胞用胞质内、核和/或表面标记物培养外周血样本，并且通过免疫细胞化学、分子和/或细胞遗传学技术来检测和识别细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170524 ES P2017307241.一种用于识别个体在外周血中循环的非肿瘤上皮细胞的方法，包括以下步骤：根据循环上皮细胞用胞质内、核和/或表面标记物培养外周血样本，并且通过免疫细胞化学、分子和/或细胞遗传学技术来检测和识别细胞。


2.根据前述权利要求所述的方法，还包括对个体的外周血样本进行梯度密度分离的优先步骤。


3.根据前述权利要求所述的方法，其中，在梯度密度分离之后，执行包括收集中间相并用盐水缓冲液清洗的步骤，在用标记物培育样品之前。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述上皮细胞是来自肺、肝、胰腺的细胞，以及来自胃腺和肠腺、肝、生殖器官、中枢神经系统或任何它们的组合的细胞。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，细胞质内标记物选自细胞角蛋白、波形蛋白、SP1(表面活性剂A和B抗原)或它们的任何组合。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，细胞核标记物选自转录因子，优选选自Snail、Slug、SOX2或它们的任何组合。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，表面标记物选自N-钙粘蛋白，EpCam，CD44v6，AXL，EGFR，EMA，MUCIN，CD133，Sca1或它们的任何组合。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，循环肺细胞的标记物，选自：
·表面标记物：CD44v6、Sca1；
·细胞质标记物：细胞角蛋白、SP1；
·细胞核标记物：SOX2；
·它们的任何组合。


9.一种分离在外周血中循环的上皮细胞的方法，包括以下步骤：根据如权利要求1-8中任一项所述的方法，进一步的包括通过亲和分离技术分离经识别的细胞。


10.根据前述权利要求所述的分离在外周血中循环的上皮细胞的方法，其中，所述亲和分离技术选自使用物理特性的技术，使用生物学特性的技术，或两者的组合。


11.根据权利要求9或10所述的分离在外周血中循环的上皮细胞的方法，其中，所述亲和分离技术选自：磁性分离，亲和层析法，与单克隆抗体结合或与单克隆抗体一起使用的细胞毒性剂，与固相支持物结合的抗体“平移”，或它们的任何组合。


12.根据权利要求9-11中任一项所述的分离在外周血中循环的上皮细胞的方法，其中，所述亲和分离技术是通过包覆特异性抗体的磁性颗粒来实现的。

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【专利技术属性】
技术研发人员：佩德罗·约瑟·罗梅罗·帕拉西奥斯，胡安·约瑟·迪亚兹·莫雄，约瑟·安东尼奥·洛伦特·阿科斯塔，迭戈·德·米格尔·佩雷斯，玛利亚·约瑟·塞拉诺·费尔南德斯，贝尔纳迪诺·阿尔卡扎·纳瓦雷特，
申请(专利权)人：格拉纳达大学，安达卢西亚健康服务部，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES