用于制备细菌素和抗微生物肽的方法和组合物技术

在本文的一些实施方案中描述了用于制备细菌素的方法和组合物。在一些实施方案中，可以由包含编码多肽原的核酸的微生物细胞产生所述多肽原，其包含期望比例的顺式的且由切割位点隔开的细菌素。在一些实施方案中，描述了用于制备抗微生物肽和/或细菌素的指定混合物的微流体装置和方法。

Methods and compositions for the preparation of bacteriocins and antimicrobial peptides

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备细菌素和抗微生物肽的方法和组合物相关申请本申请要求2018年8月21日提交的美国临时申请第62/720,804号和2017年8月31日提交的美国临时申请第62/552,835号的权益。上述申请的内容通过引用以其整体明确地并入本文。关于序列表、表或计算机程序列表本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名称为SYNG003WOSEQUENCE.TXT的文件提供，该文件创建且上次保存于2018年8月29日，大小为402,916字节。序列表的电子格式中的信息通过引用以其整体并入本文。背景微生物有机体介导的过程可以用于多种工业过程中以生产目标产物，例如用于原料中的发酵。另外，微生物有机体可以用于在无菌环境中制造产品，如制造药物、生物制剂和化妆品。另外，微生物有机体的群体参与维持多细胞有机体的健康和代谢功能，例如作为人的消肠道和皮肤或者植物根部中的微生物菌群的培养物。这些过程的效率和功效可能受培养条件以及培养物中存在的微生物有机体的表型特征的影响。调节微生物有机体的群落，例如以减少或消除不期望的微生物有机体可以用于维持工业过程和维持包含微生物有机体的组织的健康。领域本文的实施方案一般涉及产生用于控制微生物生长的基因产物。更具体地，一些实施方案涉及用于制备细菌素的方法、试剂和微流体装置。细菌素可以在组合物中产生，如细菌素的指定混合物，其可以用于控制微生物有机体群体的生长。在一些实施方案中，抗微生物肽和/或细菌素以期望的比例在组合物中产生。
技术实现思路
一些实施方案包括制备细菌素的方法。所述方法可以包括在单个阅读框中表达包含细菌素编码序列和第二多肽编码序列的核酸，其中所述第二多肽包含细菌素或信号分子，基本上由其组成或者由其组成。所述核酸还可以包含设置在单个阅读框中的细菌素编码序列和第二多肽编码序列之间的切割位点编码序列。因此，可以产生包含细菌素、第二多肽和设置在所述细菌素和第二多肽之间的切割位点的多肽原。在一些实施方案中，所述方法还包括切割所述切割位点，从而将细菌素和第二多肽彼此分离。因此，所述方法可以产生包含细菌素和第二多肽的组合物。在一些实施方案中，第二多肽包含细菌素，基本上由其组成或者由其组成。在一些实施方案中，第二多肽包含抗微生物肽，基本上由其组成或者由其组成。在一些实施方案中，第二多肽包含信号分子，基本上由其组成或者由其组成。在一些实施方案中，由微生物细胞进行表达，所述微生物细胞不产生至少一种细菌素的功能性免疫调节剂。在一些实施方案中，微生物细胞不产生任何细菌素的功能性免疫调节剂。在一些实施方案中，所述表达在体外进行。在一些实施方案中，至少一种细菌素在其为多肽原的一部分时是无活性的。在一些实施方案中，所述方法还包括在切割之前分离多肽原。在一些实施方案中，分离包括亲和纯化多肽原，其中亲和纯化包括结合由核酸编码的亲和标签。在一些实施方案中，核酸包含在单个阅读框中的三个细菌素编码序列。在一些实施方案中，至少两种细菌素彼此不同。在一些实施方案中，所述组合物包含期望比例的细菌素、或者期望比例的信号分子和细菌素。在一些实施方案中，通过核酸的单个阅读框中的细菌素编码序列的比例或者细菌素和信号分子编码序列的比例来实现至少一部分的期望比例。在一些实施方案中，通过包含一定比例的细菌素编码序列并且还包含细菌素编码序列之间的切割位点的第二核酸来进一步实现期望比例。在一些实施方案中，通过核酸的单个阅读框中细菌素编码序列的比例来实现期望比例。在一些实施方案中，选择期望的细菌素比例以靶向不期望的微生物有机体或不期望的微生物有机体的群体，和/或选择期望的细菌素比例以平衡动物、人类器官、植物、植物根部和/或土壤(例如在植物根部和土壤的情况下)中的微生物群系(microbiome)群体。在一些实施方案中，选择期望的细菌素和信号分子的比例以控制靶标微生物细胞的遗传漂移以及刺激产生细胞的生长或产生。在一些实施方案中，期望比例包括1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、2:3、2:5、2:7、2:9、3:4、3:5、3:7、3:8、3:10、4:5、4:7、4:9、5:6、5:7、5:8、5:9、6:7、7:8、7:9、7:10、8:9或9:10的第一细菌素与第二细菌素的比例，其中第一细菌素不同于第二细菌素。在一些实施方案中，切割位点是针对野生型切割酶、变体或合成切割酶，如内肽酶。在一些实施方案中，切割位点是针对选自以下的切割酶：Arg-C蛋白酶、Asp-N内肽酶、BNPS-粪臭素、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、糜蛋白酶-高特异性、梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B)、CNBr、肠激酶，Xa因子、甲酸、谷氨酰内肽酶、颗粒酶B、羟胺、亚碘酰基苯甲酸、LysC、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、NTCB(2-硝基-5-硫氰基苯甲酸)、胃蛋白酶(pH1.3)、胃蛋白酶(pH>2)、脯氨酸内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶或胰蛋白酶。在一些实施方案中，切割位点是针对单一切割酶，并且其中切割酶在细菌素内不切割。在一些实施方案中，至少一个切割位点是针对第一切割酶，另一个切割位点是针对第二切割酶，并且第一切割酶和第二切割酶都不在细菌素内切割。在一些实施方案中，通过所述方法产生的组合物还包含信号分子(其中核苷酸还包含在单一阅读框中的信号分子的编码序列)和设置在所述信号分子和细菌素编码序列之间的切割位点序列。在一些实施方案中，信号分子选自：群体感应分子、信号转导受体配体、生长因子、激素和细胞因子，并且其中信号分子可以是野生型、突变型或合成的。在一些实施方案中，信号分子包含群体感应肽，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，多肽原的长度不超过约2000个氨基酸。在一些实施方案中，所述方法还包括表达编码第二多肽原的第二核酸，所述第二多肽原包含两种细菌素和设置在其间的切割位点，其中所述第二多肽原不同于所述第一多肽原。在一些实施方案中，切割多肽原包括对切割位点包含的肽接头的物理处理，其中肽接头是化学敏感的或pH敏感的。在一些实施方案中，所述方法还包括化学修饰细菌素。在一些实施方案中，细菌素是化学上共翻译修饰的。在一些实施方案中，在切割之后化学修饰所述细菌素。在一些实施方案中，本文所述的多肽原包含两种或更多种抗微生物肽而不是细菌素，并且在切割后，产生包含抗微生物肽的组合物。在一些实施方案中，本文所述的多肽原包含一种或多种抗微生物肽和一种或多种细菌素，并且在切割后，产生包含抗微生物肽和细菌素的混合物的组合物。一些实施方案包括分离的核酸，其包含在单个阅读框中的细菌素编码序列和第二多肽编码序列，其中第二多肽包含细菌素或信号分子，基本上由其组成或者由其组成。分离的核酸可以包含设置在细菌素编码序列之间并且在单个阅读框中的切割位点编码序列。在一些实施方案中，第二多肽包含细菌素，基本上由其组成或者由其组成。在一些实施方案中，第二多肽包含抗微生物肽，基本上由其组成或者由其组成。在一些实施方案中，第二多肽包含信号分子，基本上由其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备细菌素的方法，所述方法包括表达核酸，所述核酸包含：/n在单个阅读框中的细菌素编码序列和第二多肽编码序列，其中所述第二多肽为细菌素或信号分子；以及/n设置在所述单个阅读框中的细菌素编码序列和第二多肽编码序列之间的切割位点编码序列，/n从而产生包含所述细菌素、第二多肽和设置在其间的切割位点的多肽原。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170831 US 62/552,835;20180821 US 62/720,8041.制备细菌素的方法，所述方法包括表达核酸，所述核酸包含：
在单个阅读框中的细菌素编码序列和第二多肽编码序列，其中所述第二多肽为细菌素或信号分子；以及
设置在所述单个阅读框中的细菌素编码序列和第二多肽编码序列之间的切割位点编码序列，
从而产生包含所述细菌素、第二多肽和设置在其间的切割位点的多肽原。


2.如权利要求1所述的方法，其还包括切割所述切割位点，从而将所述细菌素和所述第二多肽彼此分离，并且从而产生包含所述细菌素和所述第二多肽的组合物。


3.如权利要求1所述的方法，其中由微生物细胞进行所述表达，所述微生物细胞不产生至少一种所述细菌素的功能性免疫调节剂。


4.如权利要求1所述的方法，其中至少一种所述细菌素在其是所述多肽原的一部分时是无活性的。


5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述组合物包含期望比例的细菌素、或者期望比例的信号分子和细菌素。


6.如权利要求5所述的方法，其中通过所述核酸的单个阅读框中的细菌素编码序列的比例或者细菌素和信号分子编码序列的比例来实现至少一部分的所述期望比例。


7.如权利要求5所述的方法，其中选择期望比例的细菌素以靶向不期望的微生物有机体或者不期望的微生物有机体的群体，和/或
其中选择期望比例的细菌素以平衡动物、人器官、植物根部或土壤中的微生物群系。


8.分离的核酸，其包含：
在单个阅读框中的细菌素编码序列和第二多肽编码序列，其中所述第二多肽为细菌素或信号分子；以及
设置在所述细菌素编码序列之间并且在所述单个阅读框中的切割位点编码序列。


9.如权利要求8所述的分离的核酸，其中所述切割位点编码序列编码切割酶的切割位点，并且其中所述细菌素编码序列不包含所述切割酶的切割位点。


10.微生物细胞，其包含与权利要求8-9中任一项所述的分离的核酸可操作地连接的启动子，其中所述微生物细胞不产生由所述分离的核酸编码的细菌素的功能性免疫调节剂。


11.分离的多肽原，其包含：
两种细菌素、和/或细菌素和信号分子；
设置在所述细菌素和/或所述细菌素和所述信号分子之间的切割位点；以及
亲和标签。


12.如权利要求11所述的分离的多肽原，其中所述切割位点是针对切割酶，并且其中所述细菌素编码序列不包含所述切割酶的切割位点。


13.组合物，其包含经选择以靶向微生物细胞或微生物细胞群体的比例的两种以上的细菌素，
其中所述细菌素中的每一种在其N-末端、C-末端、或N-末端和C-末端包含已被切割的切割序列的一部分，其中在所述细菌素的N-末端、C-末端、或N-末端和C-末端的切割序列的部分是用于相同或不同切割酶的切割位点。


14.如权利要求13所述的组合物，其中至少一些所述细菌素还包含标签。


15.如权利要求14所述的组合物，其中所述标签选自亲和标签、信号序列、或稳定性标签。


16.用于产生细菌素和/或抗微生物肽的指定混合物的方法，所述方法包括：
选择包含两种或更多种不同的细菌素和/或抗微生物肽的混合物；
在包含各自编码细菌素或抗微生物肽的离散编码基底的微流体装置中：将编码所述指定混合物中的所述抗微生物肽或细菌素的离散编码基底置于与体外转录/翻译溶液流体连通；
将所述离散编码基底与所述体外转录/翻译溶液一起温育，从而产生由所述离散编码基底编码的抗微生物肽和/或细菌素；以及
混合所述微流体装置中的所述抗微生物肽和/或细菌素，从而产生所述抗微生物肽和/或细菌素的指定混合物。


17.如权利要求16所述的方法，其还包括：
产生各自包含所述抗微生物肽和/或细菌素的指定混合物的子集的两种或更多种亚混合物，以及
组合所述亚混合物以产生所述抗微生物肽和/或细菌素的指定混合物。


18.如权利要求16所述的方法，其中选择还包括选择所述指定混合物中的两种或更多种不同的抗微生物肽和/或细菌素的化学计量。


19.如权利要求16所述的方法，其中所述抗微生物肽和/或细菌素的指定混合物包含指定化学计量，并且其中组合所述亚混合物产生所述指定化学...

【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普·卡班特，
申请(专利权)人：辛格隆股份公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE