发酵工艺制造技术

一些实施方式涉及使用包含第一核酸序列的自复制染色体外核酸分子、用微生物宿主生产目标产物的方法，该第一核酸序列的遗传活性向宿主赋予优势，可选地其中所述第一核酸分子的遗传活性是受控的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】发酵工艺
本文的实施方式涉及一种使用自复制染色体外核酸分子(auto-replicativeextra-chromosomalnucleicacidmolecule)、用微生物宿主生产目标产物的方法，该自复制染色体外核酸分子包含第一核酸序列，该第一核酸序列的遗传活性向宿主赋予优势，可选地其中所述第一核酸分子的遗传活性是受控的。
技术介绍
抗生素被广泛用作在微生物细胞中产生目标产物的选择剂。然而，存在与使用抗生素相关的诸多缺点，诸如抗生素在环境中的大规模传播。另外，在DNA构建体中编码抗生素抗性的序列代表了细胞的能量负担，并因此对产物的产量产生负面影响。当赋予抗性的基因是大基因，当其以高水平表达和/或其被组成型表达时，这种能量负担特别重要。因此，仍然需要一种替代的且甚至改进的方法，其不具有现有方法的所有缺点。
技术实现思路
在第一方面，提供了一种用微生物宿主生产目标产物的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含自复制染色体外核酸分子的微生物宿主，该自复制染色体外核酸分子包含第一核酸序列，可选地其中所述第一核酸序列的遗传活性是受控的；b)可选地，自复制染色体外核酸分子包含参与所述目标产物生产的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列的遗传活性独立于所述第一序列而受控制；c)在允许所述微生物宿主将所述第一核酸序列表达至给定水平以将自复制染色体外分子维持在生长的微生物群体中并同时遗传控制编码所述目标产物的第二序列的条件下，培养所述微生物宿主。步骤a)步骤a)包含提供微生物宿主，其包含含有第一核酸序列的自复制染色体外核酸分子，该第一核酸序列的遗传活性赋予宿主以优势，可选地其中，所述第一核酸序列的遗传活性是受控的。自复制染色体外核酸分子可以提供在微生物宿主中(例如，如本文所述的微生物细胞)。例如，宿主或宿主的前身可以事先已使用自复制染色体外核酸分子进行转化。因此，在一些实施方式中，步骤a)包含提供一种微生物细胞宿主，其包含含有第一核酸序列的自复制染色体外核酸分子，该第一核酸序列的遗传活性赋予宿主以优势，可选地其中所述第一核酸序列的遗传活性是受控的。可选的转化步骤在一些实施方式中，在仅允许已经接收了自复制染色体外核酸分子的宿主存活的条件下，使用自复制染色体外核酸分子转化微生物宿主，由此提供包含自复制染色体外核酸分子的微生物宿主。由此，在一些实施方式中，所述方法进一步包含，在步骤a)之前或期间，在仅允许已接收自复制染色体外核酸分子的宿主存活的条件下，使用自复制染色体外核酸分子转化微生物宿主，由此提供包含自复制染色体外核酸分子的微生物宿主。转化到微生物宿主中的自复制染色体外核酸分子可选地包含步骤b)的第二核酸序列。随后，可以根据步骤c)培养包含自复制染色体外核酸分子的微生物宿主。在本文实施方式的方法、用途、组合物、宿主和核酸的背景下，提供了一种包含第一核酸序列的自复制染色体外核酸分子。自复制染色体外核酸分子可以不存在基因组而存在，并且可以衍生自或包含质粒或附加体、微染色体等，或者基本上由或由质粒或附加体、微染色体等组成。该特征是有吸引力的，因为可以将更高数量(取决于所使用的质粒，从一到数百个拷贝或从10到50个拷贝)这种核酸分子的拷贝引入并维持在微生物细胞宿主中。此外，在本文实施方式的方法中可以使用任何宿主。在一些实施方式中，无需修改宿主的基因组。自复制染色体外核酸分子中存在执行本文实施方式的方法所需的遗传元件。此种自复制染色体外核酸分子通常包含复制起点、作为目标的第一核酸序列和调控区。在一些实施方式中，不受理论限制，编码免疫调节剂的第一核酸序列充当可选择的标志物，以维持宿主细胞中自复制染色体外核酸的存在和功能。在一些实施方式中，编码免疫调节剂的第一核酸序列维持自复制染色体外核酸的存在，以便可以生产产物。该产物可以改变宿主所在的环境，例如，通过发酵环境中的物质以产生一种或多种新物质。在一些实施方式中，通过提供针对已经获得突变且不生产功能性免疫调节剂、生产功能降低的免疫调节剂和/或与尚未获得突变的自复制染色体外核酸相比产生较低水平免疫调节剂的自复制染色体外核酸的选择性压力，遗传漂变被最小化。在本文实施方式的方法、用途、组合物、宿主和核酸的背景下，由所述第一核酸序列的第一核酸分子能够表现出遗传活性，所述遗传活性赋予其中存在所述第一核酸分子并且表达这种遗传活性的微生物宿主以选择优势。该遗传活性是由第一核酸分子编码的产物提供的。此外，这种遗传活性可以被控制或以低水平组成型表达，或者是可调节的，或者处于弱组成型启动子的控制之下。相信对所述活性的控制提供了限制宿主能量负担的优点。类似地，当遗传活性以低水平组成型表达或可调节或在弱组成型启动子的控制下时，可以获得限制宿主能量负担的优势。在整个申请文本中，“赋予优势”的概念可以由“赋予对细菌素的免疫力”或“赋予对细菌素的抗性”代替。在一些实施方式中，所述第一核酸序列编码本文所述的免疫调节剂，并由此给宿主赋予优势。第二核酸序列直接或间接编码目标产物。相同的描述适用于本文所述的第二核酸分子的遗传活性。在一些实施方式中，目标产物包含可用于工业过程(例如发酵工艺)的酶。发酵工艺可以在培养基中发酵至少一种化合物。在一些实施方式中，目标产物包含工业上有用的分子，例如糖类、脂质、有机分子、营养物、肥料、生物燃料、化妆品(或其前体)、药物或生物制药产品(或其前体)、或者所列项目中的两种或更多种。在本文实施方式的方法、用途、组合物、宿主和核酸的背景下，遗传活性可以是指由微生物宿主中所述第一核酸分子的存在引起的或与之相关的任何活性。所述活性的优点可以是在给定条件下(pH、温度、给定分子(诸如细菌素或两种或多种如本文所述细菌素的组合)的存在…)能够存活或者存活并生长的能力。因此，可以通过确定包含自复制染色体外核酸分子的微生物细胞/宿主的数量来评估所述活性的优势。可以在所述可选的转化步骤结束时和/或期间(但在培养步骤c)之前，或在步骤a)和培养步骤c)之前)和/或在培养步骤c)之前进行评估。在一个实施方式中，当在允许已经接收自复制染色体外核酸分子的微生物宿主存活的条件下(例如，通过针对如本文所述且在所述给定条件下存在的一种或多种细菌素具有免疫力)培养细胞时，与初始微生物细胞/宿主的数量相比，包含所存在的自复制染色体外核酸分子的微生物宿主细胞的数量未减少并且可以增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多。该评估步骤可以持续至少6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时或更长，包括任何两个列出值之间的范围。在本文实施方式的方法、用途、组合物、宿主和核酸的背景下，遗传活性的控制可以是指核酸分子(即第一和/或第二核酸分子)活性的增加或减少。因此，遗传活性的控制可以被控制或以低水平组成型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用微生物宿主生产目标产物的方法，所述方法包括以下步骤：/na)提供包含自复制染色体外核酸分子的微生物宿主，所述自复制染色体外核酸分子包含第一核酸序列，所述第一核酸序列的遗传活性向所述宿主赋予优势，其中所述第一核酸序列的所述遗传活性是受控的；/nb)可选地，所述自复制染色体外核酸分子包含参与所述目标产物生产的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列的遗传活性独立于第一序列的遗传活性而是受控的；/nc)在允许转化的微生物宿主将所述第一核酸序列表达至给定水平以将所述自复制染色体外分子维持在生长的微生物群体中并同时遗传控制编码所述目标产物的第二序列的条件下，培养所述转化的微生物宿主。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171219 EP 17208600.11.一种用微生物宿主生产目标产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含自复制染色体外核酸分子的微生物宿主，所述自复制染色体外核酸分子包含第一核酸序列，所述第一核酸序列的遗传活性向所述宿主赋予优势，其中所述第一核酸序列的所述遗传活性是受控的；
b)可选地，所述自复制染色体外核酸分子包含参与所述目标产物生产的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列的遗传活性独立于第一序列的遗传活性而是受控的；
c)在允许转化的微生物宿主将所述第一核酸序列表达至给定水平以将所述自复制染色体外分子维持在生长的微生物群体中并同时遗传控制编码所述目标产物的第二序列的条件下，培养所述转化的微生物宿主。


2.根据权利要求1所述的方法，进一步包含在步骤a)之前或期间用所述自复制染色体外核酸分子转化所述微生物宿主，其中所述自复制染色体外核酸分子可选地包含步骤b)的所述第二核酸序列，由此提供包含所述自复制染色体外核酸分子的微生物宿主。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤c)条件的至少一部分使得所述第一核酸序列不表现出所述遗传活性。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在培养步骤c)结束时纯化所述目标产物。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述目标产物是微生物生物质、所述自复制染色体外核酸分子、所述第二核酸序列的转录物、所述第二序列编码的多肽、或由所述多肽直接或间接产生的代谢物。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述微生物宿主是细菌、酵母、丝状真菌或藻类。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述第一核酸序列可操作地连接至诱导型启动子。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述第一核酸序列包含编码免疫基因的序列，所述免疫基因的表达向其宿主赋予针对...

【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普·加班特，穆罕默德·尔·巴克库里，劳伦塞·范·梅尔德伦，
申请(专利权)人：辛格隆股份公司，布鲁塞尔大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE