一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体制造技术

技术编号:24324170 阅读:59 留言:0更新日期:2020-05-29 17:35
本发明专利技术公开了一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)突变体的构建及其在制备粘膜免疫佐剂中的用途。本发明专利技术LTB突变体多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术多肽是良好的粘膜免疫佐剂,其粘膜免疫佐剂活性比野生型大肠杆菌不耐热肠毒素LTB高,同时,无毒副作用,安全有效,可以和目前广泛使用的疫苗抗原联合应用,临床应用前景良好。

A mutant of heat labile enterotoxin B subunit of Escherichia coli

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体
本专利技术涉及免疫学、预防医学领域,具体涉及一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labileenterotoxinBchain,LTB)突变体及其在制备免疫佐剂中的用途。
技术介绍
免疫接种(immunization)是用人工方法将免疫原或免疫效应物质输入到机体内,使机体通过人工自动免疫或人工被动免疫的方法获得防治某种传染病的能力。根据接种部位的不同,分为创伤性免疫接种(如注射、划痕等)和无创性接种(如滴鼻、喷雾等)。粘膜免疫系统(mucosalimmunesystem,MIS)是全身免疫系统的重要组成部分,包括肠粘膜相关淋巴组织、鼻咽粘膜相关淋巴组织、泌尿生殖道粘膜相关淋巴组织等,作为机体免疫屏障的第一道防线,MIS可有效抵抗各种微生物的入侵。与皮下或肌肉注射等创伤性免疫相比,粘膜免疫比传统的免疫方式更具有优势。首先是免疫途径的差异,粘膜免疫主要采用口服、滴鼻或生殖道接种的方法,这种新型的免疫方式可避免针剂对机体刺激,减少针尖对皮肤损伤引起的炎症反应,且可多次重复接种。其次在机体的生殖道、消化道等部位广泛存在有共同粘膜免疫组织,基于此,如果某个部位的粘膜组织发生抗原提呈后产生的免疫反应通常可以刺激诱导较远的粘膜免疫应答。研究发现,粘膜免疫不仅能诱导粘膜组织分泌特异性sIgA中和表面毒素,还能同时诱导体液免疫应答,产生针对抗原的特异性抗体。目前报道的鼻粘膜免疫的佐剂主要为细菌毒素,如,大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxin,LT)和霍乱毒素(choleratoxin,CT)是有效的粘膜免疫佐剂。但他们存在的毒性限制了临床应用例如,美国于2003年上市的一种流感疫苗以LT为佐剂,接种后中发现其可产生贝尔麻痹等严重副作用而停止使用。为了避免毒性,人们试图将无毒性的LT的B亚单位(LTB)用做佐剂,但是,由于LTB的佐剂活性不高,只有LT的70%左右,因此,其临床应用收到严重的影响。至今没有LTB用于临床的报道或者案例。
技术实现思路
为了提高LTB的佐剂活性,满足临床所需,本专利技术提供了一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)突变体(LTB26)其用途。本专利技术的技术方案包括:一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体,其氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。前述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体在制备免疫佐剂中的用途。前述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体作为免疫佐剂在制备疫苗中的用途。如前述的用途,所述疫苗是粘膜接种用疫苗。如前述的用途,所述疫苗是抗病毒疫苗。如前述的用途,所述疫苗是以人轮状病毒VP8蛋白(简称VP8)为免疫原的疫苗。一种免疫佐剂,所述免疫佐剂内含有前述的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体。一种疫苗,所述疫苗含有免疫原以及免疫佐剂,所述免疫佐剂是如权利要求前述的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体,或前述的免疫佐剂。如前述的疫苗,所述疫苗是粘膜接种用疫苗。如前述的疫苗,所述疫苗是抗病毒疫苗。如前述的疫苗,所述疫苗是以人轮状病毒VP8蛋白为免疫原的疫苗。本专利技术具有如下有益效果:本专利技术的LTB26相比野生型LTB,具有更高的佐剂活性。实验表明,LTB26与VP8蛋白联用可以高度激活免疫系统,产生的特异性IgG以及sIgA抗体比LTB和VP8联用的组别高出几乎一倍。显然,根据本专利技术的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式,对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1本专利技术中表达纯化的LTB、LTB26的SDS-PAGE检测图;1:蛋白质marker;2:LTB;3:LTB26突变体。图2本专利技术中通过滴鼻(粘膜)免疫检测LTB突变体(LTB26)佐剂活性的检测结果;所测样本为血清中的人轮状病毒VP8的特异性抗体(IgG)滴度,VP8组与VP8+LTB,VP8+LTB26组间差异显著(p<0.01)。图3本专利技术中通过滴鼻(粘膜)免疫检测LTB突变体(LTB26)佐剂活性的检测结果;样本为肺洗液中的人轮状病毒VP8的分泌性特异性抗体(sIgA)滴度,VP8组与VP8+LTB,VP8+LTB26组间差异显著(p<0.01)。具体实施方式实验材料和试剂:雄性BALB/c小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。T4连接酶,Taq酶,SalI,BamHI,蛋白质Marker,DNAMarker,PlasmidMinikitI,Cycle-PureKit,胶回收试剂盒,IPTG,氨苄青霉素,BCA蛋白浓度测定试剂盒,PMSF等试剂。实施例1本专利技术具有粘膜免疫佐剂活性的多肽的制备本专利技术具有免疫佐剂活性的多肽LTB26的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。该多肽序列与大肠杆菌2788150株等大肠杆菌的野生型LTB相比,含信号肽的LTB的I26,T27,L28突变为LTB26的M26,S27,N28;LTB的L29,C30在LTB26中缺失,LTB的32E,33Y,34H突变为LTB26的32T,33I,34N(备注:谷氨酸(E),天冬酰胺(N),异亮氨酸(I),赖氨酸(L),苏氨酸(T),蛋氨酸(M)),其余部分的氨基酸序列与LTB完全相同。经PUBMED检索发现该突变区域位于LTB的GM1受体结合区域(文献DOI:10.1080/14760584.2016.1182868)。以下用实验例的方式说明本专利技术的有益效果:实验例1实验材料VP8、LTB、LTB26的制备:1、重组表达1.1pET32-LTB、pET32-LTB26、pET32-VP8基因克隆与表达a、合成重组目的基因:(1)pET32-LTB和pET32-VP8分别是在pET32载体多克隆位点插入野生型LTB基因和VP8基因得到的重组质粒,且不在本专利技术的权利要求中,GenBank中VP8序列号为KF414619.1,用化学法合成。LTB26为随机突变选择得到,经测序,其翻译的氨基酸序列如SEQNO:1所示,下划线黑体字部分为突变位点,斜体字NS之间缺失2个氨基酸:GSPOSMSNSTINNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISMEN.(2)大肠杆菌LTB蛋白的GenBank号为EU113252,其翻译的氨基酸序列如SEQNO:2所示,下划线斜体部分为在LTB26中被突变的位点:GAPQSITELCSEYHNTQIYTINDKILSYTESMAGKREM本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体,其特征在于:其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.权利要求1所述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体在制备免疫佐剂中的用途。


3.权利要求1所述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位突变体作为免疫佐剂在制备疫苗中的用途。


4.如权利要求3所述的用途,其特征在于:所述疫苗是粘膜接种用疫苗。


5.如权利要求3或4所述的用途,其特征在于:所述疫苗是抗病毒疫苗。


6.一种免疫佐剂,其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员:马永平
申请(专利权)人:重庆医科大学
类型:发明
国别省市:重庆;50

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