海洋中含细菌叶绿素的微生物的定量方法技术

海洋中含细菌叶绿素的微生物的定量方法，涉及一种微生物的定量方法。将样品预过滤、固定、DAPI染色、过滤并制片；用配有照相机和汞灯的全自动落式荧光显微镜进行观察，以不同的荧光激发块对同一视野的红外荧光、蓝细菌红色荧光和DAPI蓝色荧光图像进行观察和拍照，所有的图像均通过自动曝光获得，显微聚焦后，进行IR、Cyano和DAPI图像时间序列上的获取；用Image-Pro?Plus软件对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；在一个相同的视野下，分别获得时间序列下初始时间的IR图像、平台期的Cyano图像和初始时间的DAPI图像，并分别获得相应的二元数字化图像，即得海洋中BCM的丰度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种微生物的定量方法，尤其是涉及一种基于时间序列观察、自动成像和数字化分析的落式荧光显微镜法的海洋环境中独特的含细菌叶绿素(Bchl.a)的微生物群的准确定量方法，
技术介绍
含细菌叶绿素的微生物(BCM，Bacteriochlorophyll a Containing Microbes) 是海洋环境微生物群落中一类具有特殊功能的组分，由于缺少有效的丰度计数用于构建其动力学数据，其生态功能还不是很清楚。好氧不产氧光合异养细菌(AAPB，Aerobic Anoxygenic Phototrophic Bacteria)是一类新近认识的BCM主要类群，已经有报道表明， 这类菌群对海洋碳循环有着极其重要的作用。全面理解AAPB的广泛分布和独特功能将对目前建立在产氧光合作用基础上的海洋能量和氧平衡的理解产生深远的影响。然而一直以来，由于单细胞细菌叶绿素含量很低，且受叶绿素的红外干扰，BCM的准确定量比较困难。目前为止，用于海洋中BCM的计数方法主要有以下几种红外快速脉冲速率 (IRFRI )诱导荧光瞬时动力学技术(Kolber et al.，2000)、红外落式荧光显微镜技术 (IREM) (Kolber et al.，2001)、高效液相色谱法(HPLC) (Goericke，2002)、双重调节技术 (dual modulation techniques) (Koblizek et al. ,2005)和定量聚合酶链式反应(QPCR) (Schwalbach and Fuhrman, 2005)等。上述各种方法中，无论是监测细菌光合作用过程中电子传递的IRFRR技术，还是直接测定细菌叶绿素a和叶绿素a的含量及比值(BChl. a/Chl. a)的HPLC技术以及基于光合基因的定量QPCR技术都不能直接提供海洋中BCM的丰度，实现对微生物功能群的直接测量。而以BChl. a所发的红外荧光为检测信号IREM技术则是检测海洋中BCM丰度的最简便的方法(Kolber et al. ,2001 ；Schwalbach and Fuhrman，2005)。但是，实践发现，所有含叶绿素的自养生物都会被IREM法计入BCM中，因为它们在适当波长的光的激发下都能在一定程度上发出红外荧光。而野外海水样中，蓝细菌(海洋环境中常见的属为原绿球藻和聚球藻)的丰度大到足以干扰BCM计数，导致了 IREM法的显著阳性误差(Zhang and Jiao 2004； Schwalbach and Fuhrman，2005)。申请者在东海的检测分析发现，浅水域中由聚球藻所引进的正误差可高达30% (Zhang and Jiao2007)。即便是应用此类蓝细菌(聚球藻)的红色荧光图像从细胞粒径上或者通过红外、红色荧光信号的差减进行误差校正，而由另一类蓝细菌——原绿球藻所引进的误差则又无法计算。因为原绿球藻不仅粒径与细菌细胞相似， 而且所发出的红色荧光信号可被海水样中共存的具强荧光的聚球藻(Synechococcus)所掩盖，从而在最初的蓝细菌红色荧光视野下无法被观察到。在经典的落式荧光显微镜(EM) 或IREM法中，为了防止聚球藻荧光猝灭而进行快速观察，导致在采用最初的蓝细菌图像进行误差校正时，而无法实现原绿球藻对BCM计数造成的严重误差的校正Ghang and Jiao 2004 ；Schwalbach and Fuhrman,2005)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对IREM法不能解决的聚球藻和原绿球藻共存所引起的海洋中BCM计数的误差，提供一种新的能对海洋中BCM进行准确定量的。本专利技术的技术方案是基于时间序列观察的扣除蓝细菌误差的红外落式荧光 M '1 Ia (Time-series observation based cyanobacteria~calibrated Infrared Epifluorescence Microscopy, TIREM)，该法能准确计算出聚球藻和原绿球藻的总数，再通过逻辑运算从而对海洋中BCM进行准确计数。本专利技术包括以下步骤1)将样品预过滤、固定、DAPI (4' 6-diamidino-2_phenylindole，一种双链 DNA 荧光染料)染色、过滤并制片；2)用配有红外敏感的电子耦合组件(CCD)照相机和汞灯的全自动落式荧光显微镜进行观察，以不同的荧光激发块分别对同一视野的红外荧光(IR)、蓝细菌红色荧光 (Cyano)和DAPI蓝色荧光图像进行观察和拍照，所有的图像均通过自动曝光获得，显微聚焦后，进行IR、Cyano和DAPI图像时间序列上的获取；在步骤2)中，所述汞灯可采用IOOW汞灯(OLYMPUS U-LH100HGAP0)；所述以不同的荧光激发块可采用3组不同的荧光激发块；所述显微聚焦后，进行^、Cyano和DAPI图像时间序列上的获取可每隔60s获取一张图像，持续10 15min。3)用 Image-Pro Plus(IPP)软件(Media Cybernetics, Inc.)对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；4)计算在一个相同的视野下，分别获得时间序列下初始时间的顶图像(记为图像a)、平台期的Cyano图像(记为图像b)和初始时间的DAPI图像(记为图像c)，并分别获得相应的二元数字化图像(记为图像d、图像e和图像f)，则海洋中BCM的丰度=Boolean AND -Boolean AND ，其中 “Boolean AND” 指“逻辑运算与”。在步骤4)中，所述平台期的Cyano图像是时间序列观察中获得的蓝细菌数目最大的图像，同时包括聚球藻和原绿球藻。本专利技术的优势在于技术的普及性(落式荧光显微镜在一般实验室均有提供)；容易操作且花费小；能够在单细胞水平上将海洋中BCM、聚球藻和原绿球藻与样品中的其它细菌区别开来，从而可对海洋中的BCM进行准确计数。具体实施例方式1)将所采样品先以20 μ m的筛绢预过滤以除去大的有机生物体和无机物颗粒，后用终浓度为2%的多聚甲醛(PFA)固定15min，再以终浓度为5μ g/ml的DAPI染色30min， 之后细胞被过滤到0.2μπι孔径的黑色聚碳酸酯(PC)膜(Whatman)上。剪取1/4膜样，细胞面朝上置于玻片上，滴上防猝灭镜油，盖上盖玻片。2)用全自动落式荧光显微镜(OLYMPUS BX61)对制片进行观察，所用的荧光激发块如下所示。含红外荧光的细胞所用的荧光激发块(Chroma Technology Corp)是 350-550nm 激发，LP 850nm 发射，650nm 分光(OLYMPUS U-MWIY2) (Kolber et al. ,2001 ； Zhang and Jiao,2004) (IR-settings) 0染DAPI的细胞用于对照，其所用的荧光激发块是330-385nm 激发，420nm 发射，400nm 分光(OLYMPUS U-MWU2) (KoIber et al. ,2001 ；Zhang and Jiao，2004) (DAPI-settings)。蓝细菌(主要包括聚球藻和原绿球藻)细胞红色荧光信号所用的荧光激发块是530-550nm激发，475IFn本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．海洋中含细菌叶绿素的微生物的定量方法，其特征在于包括以下步骤：１）将样品预过滤、固定、ＤＡＰＩ染色、过滤并制片；２）用配有红外敏感的电子耦合组件照相机和汞灯的全自动落式荧光显微镜进行观察，以不同的荧光激发块分别对同一视野的红外荧光、蓝细菌红色荧光和ＤＡＰＩ蓝色荧光图像进行观察和拍照，所有的图像均通过自动曝光获得，显微聚焦后，进行ＩＲ、Ｃｙａｎｏ和ＤＡＰＩ图像时间序列上的获取；３）用Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ　Ｐｌｕｓ软件对图像中的细胞进行识别和分析，并获得新的二元数字化图像；４）计算：在一个相同的视野下，分别获得时间序列下初始时间的ＩＲ图像、平台期的Ｃｙａｎｏ图像和初始时间的ＤＡＰＩ图像，并分别获得相应的二元数字化图像，则海洋中ＢＣＭ的丰度＝Ｂｏｏｌｅａｎ　ＡＮＤ［（ｄ），（ｆ）］－Ｂｏｏｌｅａｎ　ＡＮＤ［（ｄ），（ｅ）］，其中“Ｂｏｏｌｅａｎ　ＡＮＤ”指“逻辑运算与”。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：焦念志，张瑶，赵子豪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92