戊糖发酵性发酵细菌属性状转化微生物制造技术

本发明专利技术提供一种性状转化微生物，其针对不能利用戊糖的发酵细菌属微生物，用重组ＤＮＡ方法，导入戊糖代谢系酶，从而能够由戊糖生产乙醇。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的外源基因的重组DNA，以及含有该重组DNA片段的性状转化微生物，该性状转化微生物能够用于由含有木糖的原料高效地生产乙醇。
技术介绍
以纤维素类生物质为原料生产乙醇的场合，首先，要用由生物质分解至单糖的糖化液作为发酵原料。纤维素类生物质的分解、糖化中，采用使用纤维素酶的酶法或使用硫酸等的酸糖化法等，但由于生物质中还有纤维素以外的半纤维素含量高的物质，所以该糖化液中除葡萄糖外，还会含有来源于半纤维素的木糖。乙醇生产中所用的主要微生物有酵母属的酵母和发酵单胞菌属或发酵细菌属的细菌。通常，这些微生物由葡萄糖等糖高效地生产乙醇，但不能由木糖生产乙醇。因此，为了提高以生物质为原料的乙醇的生产收率，有必要将与木糖代谢有关的酶导入乙醇生产所用的微生物中，构建能够以木糖为底物生产乙醇的性状转化微生物。已知发酵单胞菌属和发酵细菌属的细菌其发酵速度比酵母属的酵母快，例如，美国专利N0.5,712,133号的说明书中，公开了通过将戊糖发酵性性状转化至发酵单胞菌属的细菌，构建了能够由木糖高效地生产乙醇的性状转化微生物。但是，发酵单胞菌属的细菌与发酵细菌属的细菌相比，能够发酵的糖种类少，为了对含有麦芽糖和半乳糖或甘露糖等的原料高效地进行发酵，必须用更多的基因进行性状转化。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种性状转化微生物，其针对不能利用戊糖的发酵细菌属的微生物，用重组DNA的方法，导入戊糖代谢系酶，从而具有由戊糖生产乙醇的能力。本专利技术者着眼于具有木糖分解能力的微生物，进行各种筛选，能得到与木糖的代谢有关的木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶的基因。但由于发酵细菌属细菌的宿主-载体系统尚未建立，所以对载体的构建、性状转化方法、编码木糖代谢关联酶的基因的克隆等进行了反复努力的研究，结果，这回发现，采用发酵性糖种类范围广的发酵细菌属细菌作为宿主时，容易适合于含各种糖的发酵原料，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术提供一种性状转化微生物，其具有导入编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的外源基因的发酵细菌属的戊糖发酵性，也就是说，具有以戊糖、特别是木糖为底物生产乙醇的能力。本专利技术还提供将来源于木糖代谢系酶生产性菌株的、含有编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的基因的DNA片段与载体结合而构成的重组DNA。附图说明图1是由木糖生物合成乙醇的途径的图。图2是含有大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的重组质粒的限制酶酶切位点图。图3是含有大肠杆菌来源的转醛酶基因和转酮酶基因的重组质粒的限制酶酶切位点图。图4是含有4种木糖发酵性基因的重组质粒的限制酶酶切位点图。图5是表示用重组棕榈发酵细菌株由木糖生产乙醇的结果的图。图6是表示用重组棕榈发酵细菌株由木糖批式发醇生产乙醇的性能的图。以下，对本专利技术进一步详细地说明。本专利技术中，用具有木糖分解能力的微生物作为DNA供体，然后，分离、纯化编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的DNA后，用各种方法切断，制备编码该酶的DNA片段。将此片段与适当的载体DNA片段通过例如DNA连接酶等使其结合，形成含有选自木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转醛酶基因和转酮酶基因中至少一种基因的重组DNA。对本专利技术中使用的含有该基因的DNA供体微生物无特别的限制，只要具有分解木糖的能力都可以使用，特别适用的是属于埃希氏菌属、黄单胞菌属、克雷伯氏菌属、红细菌属、黄杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、根瘤菌属、土壤杆菌属(abrobacterium)、沙门氏菌属和假单胞菌属的微生物。其中优选大肠杆菌。其它的埃希氏菌属微生物或上述以外的微生物中，具有分解木糖能力的微生物，以及因启动子部位或核糖体结合部位的异常而没有分解木糖的能力，但在其DNA上编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶或转酮酶结构基因的微生物，也可以作为含有该基因的DNA供体使用。进一步通过基因重组等，导入了木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶或转酮酶结构基因的性状转化微生物等也可以作为含有该基因的DNA供体微生物使用。也可以将由不同微生物得到的多种含有该基因的DNA片段与1个载体结合。含有选自木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转醛酶基因和转酮酶基因中至少一种基因的重组DNA，通过导入作为宿主的属于发酵细菌属的微生物，可以构建成具有生产木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和/或转酮酶能力的性状转化微生物。导入的重组DNA的全部或一部分可以整合到发酵细菌属宿主细胞的基因组中，或者也可以存在于性状转化所用的载体上。DNA从上述供体微生物的分离、纯化可以用其本身已知的方法进行，例如齐藤·三浦等的方法(Biochem.Biophys.Acta.Vol.72，619-629，1963)及其改进的方法，还可通过使用市售的DNA提取试剂盒等的方法等进行。以下，对按照齐藤·三浦等的方法进行的方法进一步进行具体说明。首先，将供体微生物接种于含有0.5％甘氨酸的酵母-淀粉培养基(组成酵母提取物0.2％，可溶性淀粉1.0％，pH7.3)等合适的液体培养基中，4-60℃下，优选30℃下，搅拌培养8-48小时，优选搅拌培养过夜。培养结束后，通过固-液分离操作，例如在0-50℃，优选4℃、转速为3000-15000rpm，优选10000rpm的条件下进行离心分离，收集菌体。然后将收集的微生物悬浮于VS缓冲液(0.15M NaCl，0.1M EDTA，pH8.0)中，加入溶菌酶后，在4-45℃，优选37℃，放置0.5-4小时，优选放置1小时，得到原生质体液。在该液体中加入TSS缓冲液(0.1MTris，0.1M NaCl，1％SDS，pH9.0)和5M NaCl，使原生质体溶解。接着，加入TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)-饱和酚，使其平稳、充分地悬浮。将所得的悬浮液在0-50℃，优选4℃，转速为3000-15000rpm，优选12000rpm下离心分离，得到的上层(水相)悬浮于氯仿中。进一步将其在0-50℃，优选4℃、转速为3000-15000rpm，优选12000rpm下进行离心分离，得到的上层(水相)再次用酚及氯仿进行悬浮处理。随后加入冷的乙醇，回收生成的白色混浊的粗染色体DNA，将该DNA溶解于SSC缓冲液(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)中，对SSC缓冲液透析过夜。将核糖核酸酶按终浓度为1-50μg/ml，优选10μg/ml的量加入该透析内液中，在4-45℃，优选37℃，放置0.5-16小时，优选放置2小时。再加入终浓度为0.1-10μg/ml，优选1μg/ml的蛋白酶，在4-45℃，优选在37℃，放置15分钟-8小时，优选放置30分钟。然后与上述同样，将其用酚及氯仿处理、对SSC缓冲液透析，得到纯化的供体微生物的染色体DNA溶液。用限制酶等分解上述所得的供体微生物的DNA，用蔗糖密度梯度法除去1kbp以下的DNA片段，可以将得到的物质用作供体DNA片段。此时所用的限制酶无特别的限定，可以使用切断DNA的AccII(别名FnuDII)等各种酶类。此外，除了上述的酶法以外，也可以用超声波处理或物理剪断力等将DNA切断。在这种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵细菌属的戊糖发酵性性状转化微生物，其导入了编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶、转酮酶中至少１种酶的外源基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁濑英司，冈本贤治，高寺贵秀，杉浦敦子，
申请(专利权)人：关西涂料株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]