具有减少的扩增偏倚的高通量单细胞测序制造技术

本文提供了用于制备测序文库的方法，所述测序文库包括来自多个单细胞的核酸。在一个实施方案中，该方法包括核酸的线性扩增。在一个实施方案中，测序文库包括来自多个单细胞的全基因组核酸。在一个实施方案中，核酸包括三个索引序列。本文还提供了组合物，例如包括具有三个索引序列的核酸的组合物。

High throughput single cell sequencing with reduced amplification bias

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有减少的扩增偏倚的高通量单细胞测序相关申请的交叉引用本申请要求2018年5月17日提交的美国临时申请序列号62/673,023和2019年3月21日提交的美国临时申请序列号62/821,864的权益，其各自通过引用全部合并于此。政府支持本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的DP1HG007811号政府资助下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。
本公开的实施方案涉及核酸测序。特别地，本文提供的方法和组合物的实施方案涉及产生索引的单细胞测序文库并从中获得用于表征稀有事件(包括交换(crossover)和染色体错误分离事件)的序列数据。在一些实施方案中，该方法涉及在单细胞水平上解析癌症异质性。
技术介绍
当代的单细胞基因组测序技术有两个主要限制。首先，大多数方法需要对单个细胞区室化，这可能限制通量。第二，大多数扩增方法是基于PCR的，且因此存在指数扩增偏倚。为了解决第一个问题，我们和同事们开发了单细胞组合索引(“sci-”)，其中执行数轮分割-合并条码化以唯一地标记单细胞的核酸内容物，从而实现每一个相继的索引轮次通量的指数增长。已成功开发出Sci-方法来分析大量单细胞中的染色质可及性(sci-ATAC-seq)、转录组(sci-RNA-seq)、基因组(sci-DNA-seq)、甲基化组(sci-MET)、染色体构象(sci-Hi-C)(Cao等,2017,Science357:661–667；Cusanovich等,2015,Science,348:910-914；Mulqueen等,2018,Nat.Biotechnol.36:428-431；Ramani等,2017,Nat.Methods14:263-266；Vitak等,2017,Nat.Methods14:302-308)。为了解决第二个问题，通过基于T7的转录的线性扩增提供了一种可能的解决方案，其先前已用于单细胞分析的情况中(Eberwine等,1992；ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences89:3010-3014；Hashimshony等,2012,CellRep.2:666-673；Sos等,2016,GenomeBiolol.,17:20)。例如，最近，Chen等人开发了通过转座子插入的线性扩增(“LIANTI”)，其使用Tn5转座子使基因组片段化，并同时插入用于体外转录(IVT)的T7RNA启动子。从DNA模板产生的RNA拷贝不能用作进一步扩增的模板。因此，所有拷贝直接来源于原始DNA模板。通过避免指数扩增，LIANTI保持均匀性并使序列错误最小化。但是，该方法是低通量的，因为它需要从每个单细胞制备系列文库(Chen等,2017,Science356:189-194)。
技术实现思路
本文描述了整合单细胞组合索引和线性扩增以最小化扩增偏倚而同时实现通量的指数增长的方法。通过多轮分子条码化，该方法将每实验的通量提高到至少数千个和可能数百万个细胞，同时保留了线性扩增的优势。专利技术人通过单细胞全基因组测序(“sci-L3-WGS”)、靶向基因组测序(“sci-L3-靶-seq”)及基因组和转录组的共分析(“sci-L3-RNA/DNA”)的概念验证演示证明了该方法的普遍适用性。作为进一步的证明，单细胞全基因组测序应用于定位来自不育的、种间(B6xSpretus)F1雄性小鼠以及可育的、种内(B6xCast)F1雄性小鼠的不成熟和成熟雄性生殖细胞中前所未有数量的减数分裂交换和稀有染色体错误分离事件。定义除非另有说明，否则本文中使用的术语应理解为具有相关领域中的普通含义。本文列出本文中使用的几个术语及其含义。如本文所用，术语“生物体”、“受试者”可互换使用，并且是指微生物(例如原核或真核的)、动物和植物。动物的例子是哺乳动物，例如人。如本文所用，术语“细胞类型”旨在基于形态、表型、发育起源或其他已知或可识别的区别性细胞特征来鉴定细胞。可以从单个生物体(或从相同物种的生物体)获得多种不同的细胞类型。示例性细胞类型包括但不限于配子(包括雌配子，例如卵或卵细胞，和雄配子，例如精子)、卵巢上皮、卵巢成纤维细胞、睾丸、膀胱、免疫细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、癌细胞、真核细胞、干细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞、骨细胞、胰腺细胞、内皮细胞、胰腺上皮、胰腺α、胰腺β、胰腺内皮、骨髓淋巴母细胞、骨髓B淋巴母细胞、骨髓巨噬细胞、骨髓成红细胞、骨髓树突状、骨髓脂肪细胞、骨髓骨细胞、骨髓软骨细胞、早幼粒细胞、骨髓原巨核细胞、膀胱、脑B淋巴细胞、脑神经胶质、神经元、脑星形胶质细胞、神经外胚层、脑巨噬细胞、脑小胶质细胞、脑上皮、皮质神经元、脑成纤维细胞、乳腺上皮、结肠上皮、结肠B淋巴细胞、乳腺上皮、乳腺肌上皮、乳腺成纤维细胞、结肠肠上皮细胞、子宫颈上皮、乳腺导管上皮、舌上皮、扁桃体树突状、扁桃体B淋巴细胞、外周血成淋巴细胞、外周血T成淋巴细胞、外周血皮肤T淋巴细胞、外周血自然杀伤、外周血B淋巴母细胞、外周血单核细胞、外周血成肌细胞、外周血成单核细胞、外周血早幼粒细胞、外周血巨噬细胞、外周血嗜碱性粒细胞、肝内皮、肝肥大、肝上皮、肝B淋巴细胞、脾内皮、脾上皮、脾B淋巴细胞、肝脏肝细胞、肝脏、成纤维细胞、肺上皮、支气管上皮、肺成纤维细胞、肺B淋巴细胞、肺雪旺氏细胞、肺鳞状、肺巨噬细胞、肺成骨细胞、神经内分泌、肺泡、胃上皮和胃成纤维细胞。如本文所用，术语“组织”旨在表示一起发挥作用以在生物体中执行一种或多种具体功能的细胞的集合或聚集体。细胞可以任选地在形态上相似。示例性组织包括但不限于胚胎、附睾、眼睛、肌肉、皮肤、肌腱、静脉、动脉、血液、心脏、脾脏、淋巴结、骨骼、骨髓、肺、支气管、气管、肠、小肠、大肠、结肠、直肠、唾液腺、舌头、胆囊、阑尾、肝脏、胰腺、脑、胃、皮肤、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、性腺、睾丸、卵巢、子宫、输卵管、胸腺、垂体、甲状腺、肾上腺或甲状旁腺。组织可以源自人类或其他生物体的多种器官中的任何一种。组织可以是健康组织或不健康组织。不健康组织的例子包括但不限于生殖组织、肺、乳腺、结肠直肠、前列腺、鼻咽、胃、睾丸、皮肤、神经系统、骨骼、卵巢、肝脏、血液组织、胰腺、子宫、肾脏、淋巴组织等的恶性肿瘤。恶性肿瘤可以是多种组织学亚型，例如癌、腺癌、肉瘤、纤维腺癌、神经内分泌或未分化的。如本文所用，术语“核小体”是指染色质的基本重复单元。人类基因组由压实在平均直径约10μm的细胞核内的几米DNA组成。在真核细胞细胞核中，DNA被包装成核蛋白复合物，称为染色质。核小体(染色质的基本重复单元)通常包括约146个碱基对的DNA，其在核心组蛋白八聚体周围包绕约1.7次。组蛋白八聚体由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各自的两个拷贝组成。核小体以成串的珠的方式沿DNA规则间隔。如本文所用，术语“隔室”旨在表示将某物与其他事物分离或隔离的区域或体积。示例性的隔室包括但不限于小瓶、管、孔、液滴、大丸、珠、容器、表面特征或通过诸如流体流、磁性、电流等物理力分开的区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备测序文库的方法，所述测序文库包含来自多个单细胞核或单细胞的核酸，所述方法包括：/n在第一多个隔室中提供多个分离的细胞核或细胞，/n其中每个隔室包含分离的细胞核或细胞的子集，和/n其中所述细胞核或细胞包含核酸片段；/n向所述细胞或细胞核引入线性扩增介体；/n通过线性扩增来扩增所述核酸片段；/n处理细胞核或细胞的每个子集以生成索引的细胞核或细胞，/n其中所述处理包括向所述分离的细胞核或细胞中存在的核酸片段添加第一隔室特异性索引序列以产生在分离的细胞核或细胞中存在的索引的核酸，/n其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座；/n组合所述索引的细胞核或细胞以产生合并的索引的细胞核或细胞，从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180517 US 62/673,023;20190321 US 62/821,8641.一种制备测序文库的方法，所述测序文库包含来自多个单细胞核或单细胞的核酸，所述方法包括：
在第一多个隔室中提供多个分离的细胞核或细胞，
其中每个隔室包含分离的细胞核或细胞的子集，和
其中所述细胞核或细胞包含核酸片段；
向所述细胞或细胞核引入线性扩增介体；
通过线性扩增来扩增所述核酸片段；
处理细胞核或细胞的每个子集以生成索引的细胞核或细胞，
其中所述处理包括向所述分离的细胞核或细胞中存在的核酸片段添加第一隔室特异性索引序列以产生在分离的细胞核或细胞中存在的索引的核酸，
其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座；
组合所述索引的细胞核或细胞以产生合并的索引的细胞核或细胞，从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增在所述处理之前发生。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理在所述扩增之前发生。


4.一种用于制备测序文库的方法，所述测序文库包含来自多个单细胞核或单细胞的核酸，所述方法包括：
提供多个分离的细胞核或细胞，
其中细胞核或细胞包含核酸片段；
向所述分离的细胞核或细胞引入线性扩增介体；
将所述分离的细胞核或细胞分布到第一多个隔室中，
其中每个隔室包含分离的细胞核或细胞的子集；
通过线性扩增来扩增所述核酸片段；
处理分离的细胞核或细胞的每个子集以生成索引的细胞核或细胞，
其中所述处理包括向所述分离的细胞核或细胞中存在的核酸片段添加第一隔室特异性索引序列以产生在分离的细胞核或细胞中存在的索引的核酸，
其中所述处理包括连接、引物延伸、扩增或转座；
组合所述索引的细胞核以产生合并的索引的细胞核或细胞，从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。


5.一种用于制备测序文库的方法，所述测序文库包含来自多个单细胞核或单细胞的核酸，所述方法包括：
在第一多个隔室中提供多个分离的细胞核或细胞，
其中每个隔室包含分离的细胞核或细胞的子集，和
其中细胞核或细胞包含核酸片段；
处理细胞核或细胞的每个子集以生成索引的细胞核或细胞，
其中所述处理包括向存在于所述分离的细胞核或细胞中的核酸片段添加(i)第一隔室特异性索引序列以产生分离的细胞核或细胞中存在的索引的核酸和(ii)被线性扩增介体识别的核苷酸序列，
其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或转座；
向所述细胞或细胞核引入线性扩增介体；
通过线性扩增来扩增所述核酸片段；
组合所述索引的细胞核或细胞以产生合并的索引的细胞核或细胞，从而从所述多个细胞核或细胞产生测序文库。


6.根据权利要求1、4或5中任一项所述的方法，其中所述线性扩增介体包括噬菌体RNA聚合酶或线性扩增引物。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸片段包含T7启动子，且所述噬菌体RNA聚合酶包括T7RNA聚合酶。


8.根据权利要求6所述的方法，其中引入所述线性扩增介体包括向所述分离的细胞核或细胞中存在的核酸片段添加所述线性扩增介体。


9.根据权利要求1或5所述的方法，其进一步包括将每个隔室的所述多个分离的细胞核或细胞暴露于预定条件。


10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括在所述暴露后从所述多个细胞分离细胞核。


11.根据权利要求4所述的方法，进一步包括将所述多个分离的细胞核或细胞暴露于预定条件。


12.根据权利要求1、4或5中任一项所述的方法，其进一步包括使所述分离的细胞核经受产生核小体耗尽的细胞核而同时保持所述分离的细胞核的完整性的条件。


13.根据权利要求1、4或5中任一项所述的方法，其中所述处理包括：
使每个子集与转座体复合物接触，
其中在每个隔室中所述转座体复合物包含与其他隔室中的第一索引序列不同的所述第一索引序列；和
使所述子集中的核酸片段化为多个核酸，并将所述第一索引序列并入所述核酸的至少一条链中以产生包含所述索引的核酸的所述索引的细胞核或细胞。


14.根据权利要求1、4或5中任一项所述的方法，其中所述处理包括：
使每个子集接触逆转录酶及与所述分离的细胞核中的RNA分子退火的引物，其中每个隔室中的所述引物包含与其他隔室中的第一索引序列不同的所述第一索引序列，以生成包含所述索引的核酸的所述索引的细胞核或细胞。


15.根据权利要求14所述的方法，其中所述接触进一步包括与特定核苷酸序列退火的靶特异性引物。


16.根据权利要求1、4或5中任一项所述的方法，其中添加所述第一隔室特异性索引序列的所述处理包括将包含通用序列的核苷酸序列添加至所述核酸片段和然后将所述第一隔室特异性索引序列添加至所述核酸片段的两步过程。


17.根据权利要求16所述的方法，其中所述添加包括包含通...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·J·斯蒂莫斯，J·申杜尔，殷毅，
申请(专利权)人：伊鲁米纳公司，华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：美国;US