一种利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种以非诊断治疗为目的利用PCR‑ELISA检测具核梭杆菌的方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明专利技术公开的一种以非诊断治疗为目的利用PCR‑ELISA检测具核梭杆菌的方法，采用链霉亲和素‑生物素‑地高辛‑抗地高辛抗体系统，检测敏感性为常规PCR的100倍，而且不与其他细菌如金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、沙门氏菌等产生交叉反应，特异性较好，批间及批内变异系数均低于10％，本发明专利技术建立的具核梭杆菌PCR‑ELISA检测方法敏感性、特异性、重复性均较好。

A PCR-ELISA method for detection of Fusobacterium nucleatum

【技术实现步骤摘要】
一种利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法
本专利技术涉及分子生物学检测
，更具体的说是涉及一种利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法。
技术介绍
具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，F.nucleatum)是一种革兰氏阴性无芽孢厌氧杆菌，由于其形态中间膨大，两端尖细如梭，故名为梭杆菌。F.nucleatum不容易培养，对环境的要求较高，在培养时需要创造严格的厌氧环境，一般在含有5％氢气、5％二氧化碳、90％氮气的厌氧箱中生长较好。除此之外，其对营养要求也比较苛刻，一般采用厌氧血平板培养，48小时以后形成直径约为1-2mm、圆形、表面不平、中间凸起、半透明的菌落，散发恶臭。显微镜之父列文虎克于1893年在牙菌斑中首次发现F.nucleatum，其能够引起口臭及牙周炎，是口腔中的一种常在菌，还能够引起人体肝、肺、血液、关节等部位的感染，与食管癌、口腔癌、胃癌的发生密切相关。F.nucleatum具有许多特征性的因子，最典型的为FomA、Fap2及FadA，其中FadA为F.nucleatum的一个黏附素，基因全长390bp，是一个高度保守的基因，与已知的其他类型黏附素没有同源性，其可分为两种形式，一为未分泌形式的FadA(pre-FadA)以及分泌形式的成熟FadA(mFadA)，pre-FadA由129个氨基酸残基构成，含有一个18个氨基酸组成的信号肽，mFadA由111个氨基酸残基构成，可存在于酸性环境，两种形式可以结合形成复合物，是具核梭杆菌附着及侵入宿主细胞必需的毒力因子。<br>目前，F.nucleatum的检测常以PCR为主，包括常规PCR及多重PCR技术，常规PCR技术操作简便，被广泛应用，但是常规PCR需要用溴化乙锭染色，存在一定的危险性，而且，电泳结果单纯靠肉眼观察，敏感性不强；多重PCR技术则需要设计多对引物，不好掌握。此外，环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新兴的扩增技术，利用LAMP检测具核梭杆菌，成本较低，但是对引物要求较高，适用范围小，假阳性问题也比较严重。因此，提供一种利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法，具有敏感性高、特异性好、准确度高、安全、快捷等优点，适用于样品的大批量检测。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的特异性引物，所述引物序列如下：F：5’-CACAAGCTGACGCTGCTAGA-3’；SEQIDNO.1；R：5’-TTACCAGCTCTTAAAGCTTG-3’；SEQIDNO.2；所述上游引物F的5’端用地高辛标记，所述下游引物R的5’端用生物素标记。进一步，一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法，具体步骤如下：(1)提取样品基因组DNA；(2)利用权利要求1所述的特异性引物，对步骤(1)获得的模板进行PCR扩增，获得PCR产物；(3)ELISA检测：链霉亲和素按1：800稀释包板，37℃孵育15min，2％的BSA37℃封闭15min，一抗37℃反应30min，二抗按1：2000稀释，37℃反应30min，最终显色7min；(4)确定PCR-ELISA的临界值。进一步，步骤(2)所述PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存。进一步，步骤(4)所述确定PCR-ELISA的临界值：检测样品OD450值大于或者等于0.111时判定为阳性样品，小于0.111时则为阴性样品。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法，采用链霉亲和素-生物素-地高辛-抗地高辛抗体系统，检测敏感性为常规PCR的100倍，而且不与其他细菌如金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、沙门氏菌等产生交叉反应，特异性较好，批间及批内变异系数均低于10％，本专利技术建立的具核梭杆菌PCR-ELISA检测方法敏感性、特异性、重复性均较好。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术FadA基因扩增的电泳结果；其中，M:DL-2000DNAMarker；1：目的基因；2：阴性对照；图2附图为本专利技术重组质粒测序后的比对结果；图3附图为本专利技术PCR敏感性检测电泳结果；其中，M:DL-2000DNAMark；1-11分别是重组质粒稀释浓度：5.86×1011copies/μL、5.86×1010copies/μL、5.86×109copies/μL、5.86×108copies/μL、5.86×107copies/μL、5.86×106copies/μL、5.86×105copies/μL、5.86×104copies/μL、5.86×103copies/μL、5.86×102copies/μL、5.86×101copies/μL。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。具核梭杆菌冻干粉，由美国康奈尔大学提供；阴性对照为经PCR检测为具核梭杆菌FadA基因阴性的基因组DNA；被检的4份样本为新乡市中心医院提供的结直肠癌患者3份粪便及1份组织。粪便DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自OMEGA生物技术有限公司；EXTaqDNA聚合酶、PMD-18-Tvector、DNAMarker均购自大连宝生物有限公司；链霉亲和素、牛血清白蛋白购自上海生物工程技术有限公司；TMB单组份显色液购自Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体购自鼎国公司。实施例1FadA基因的PCR扩增根据GeneBank中F.nucleatum的FadA基因设计一对特异性引物，交由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：F：5’-CACAAGCTGACGCTGCTAGA-3’；SEQIDNO.1；R：5’-TTACCAGCTCTTAAAGCTTG-3’；SEQIDNO.2。将F.nucleatum冻干粉活化，用胰酪蛋白胨大豆液体培养基在厌氧箱中操作，收集菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下：/nF：5’-CACAAGCTGACGCTGCTAGA-3’；SEQ ID NO.1；/nR：5’-TTACCAGCTCTTAAAGCTTG-3’；SEQ ID NO.2；/n所述上游引物F的5’端用地高辛标记，所述下游引物R的5’端用生物素标记。/n

【技术特征摘要】
1.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下：
F：5’-CACAAGCTGACGCTGCTAGA-3’；SEQIDNO.1；
R：5’-TTACCAGCTCTTAAAGCTTG-3’；SEQIDNO.2；
所述上游引物F的5’端用地高辛标记，所述下游引物R的5’端用生物素标记。


2.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测具核梭杆菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提取样品基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的特异性引物，对步骤(1)获得的模板进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)ELISA检测：链霉亲和素按1：800稀释包板，37℃孵育15min...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴友，李鹏，王瑞飞，刘金晶，王利平，张艳芳，魏小兵，刘明成，刘长忠，谭东鹤，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：河南;41