基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物组，包括SEQ ID NO：1～2所示的内引物对、SEQ ID NO：3～4所示的外引物对和SEQ ID NO：5～6所示的环引物对。本发明专利技术还提供了一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的试剂盒及检测方法。所述引物组能快速、特异性地扩增B族链球菌的靶标基因；所述试剂盒能对B族链球菌基因进行快速的定性检测；所建立的检测方法具有操作简便、检测时间短、检测准确性、灵敏度高等优点。

Primer set, kit and detection method of group B Streptococcus based on loop mediated constant temperature amplification

【技术实现步骤摘要】
基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物组、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物医学领域，特别涉及一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物对、试剂盒及检测方法。
技术介绍
B族链球菌是一种常见的感染细菌，孕妇感染后会出现早产、羊膜腔炎，甚至流产、死产，此外该细菌还可通过子宫或在分娩中而传染给新生儿而引起严重后果，每年大约有2200名新生儿因感染B族链球菌而死亡。对孕妇进行B族链球菌筛查可及早发现感染及时治疗，有效控制其危害。目前对B族链球菌的检测多是依赖于PCR扩增技术，但该技术通常需要昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，且存在耗时长、灵敏度低等缺点，不利于快速检测和应急检测。随着人们对于分子生物领域的不断深入研究，一种全新的核酸扩增技术—环介导恒温扩增技术(Loopmediatedisothermalamplification，LAMP)越来越受到研究人员的亲睐。该技术在操作便捷性、扩增效率、灵敏度、省时性等方面均高于PCR技术。但目前利用LAMP技术检测B族链球菌的相关研究较少，且对其的检测效率较低、准确度不高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物组、试剂盒及检测方法，以实现对B族链球菌的简单、快速、特异性检测。第一方面，本专利技术提供了一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物组，所述引物组包括内引物对、外引物对和环引物对，其中，所述内引物对包括SEQIDNO：1所示的正向内引物FIP和SEQIDNO：2所示的反向内引物BIP，所述外引物对包括SEQIDNO：3所示的正向外引物F3和SEQIDNO：4所示的反向外引物B3，所述环引物对包括SEQIDNO：5所示的正向环引物LF和SEQIDNO：6所示的反向环引物LB。可选地，所述内引物对与所述外引物对、所述环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)。优选为8：1：4。在该比例下，采用所述引物组可以实现对B族链球菌的较佳扩增效果。进一步可选地，所述正内引物FIP和反向内引物BIP的摩尔比为1：1，所述正向外引物F3和反向外引物B3的摩尔比为1：1，所述正向环引物LF和反向环引物LB的摩尔比为1：1。本专利技术第一方面提供的基于LAMP检测B族链球菌的所述引物组，是针对B族链球菌表面免疫原性蛋白sip的编码DNA上的6个特定高保守区域(F1、F2、F3、B1、B2、B3)而设计，6个区域中任一区域与所述引物组若不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。所述引物组能快速、特异性扩增B族链球菌的基因，扩增效果较佳。第二方面，本专利技术还提供了一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括核酸染料和如本专利技术第一方面所述的引物组。所述试剂盒具体利用荧光标记环介导恒温扩增技术来检测B族链球菌。可选地，所述试剂盒还包括缓冲剂、链置换DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、镁盐。其中，所述dNTPs可以为本领域常规的dNTP，包括dATP、dGTP、dTTP和dCTP。所述链置换DNA聚合酶可以在恒定温度下进行链置换和扩增，其可以包括但不限于Bst聚合酶(如Bst聚合酶1.0、Bst聚合酶2.0)、Gsp聚合酶，还可以为其他具有类似高链置换活性的DNA聚合酶。所述镁盐可以为硫酸镁或氯化镁。所述镁盐主要用于催化所述链置换DNA聚合酶的活性。可选地，所述缓冲剂可以包括Tris-HCl缓冲液(pH在7.5-9.0)、pH在6.8-8.2的HEPES缓冲液、pH＝7.0-8.0的磷酸盐(PBS)缓冲液、pH＝7.6-9.5的硼酸钠缓冲液等。在本专利技术一实施方式中，所述缓冲剂为pH在8.8的Tris-HCl缓冲液。本专利技术的所述试剂盒中的各成分可以在使用前分别包装在不同的包装中，独立地以液态或固态形式存在；或者统一在同一包装中。可选地，所述试剂盒中的各成分可以混合成冻干制剂，这样可便于试剂盒的长期储存和运输，也避免了因多次加样带来的污染及误差。当将冻干制剂形式的所述试剂盒用于检测B族链球菌时，可用含待测样本基因的溶液(如样本洗脱缓冲液)来复溶所述试剂盒中的成分，得到环介导恒温扩增的扩增反应体系，对操作人员的技术要求较低。可选地，所述试剂盒可以与恒温扩增荧光检测仪、实时荧光检测仪、其他可提供恒定温度和荧光检测的设备(如荧光定量PCR仪)等配合使用。进一步地，所述试剂盒中，所述内引物对与所述外引物对、所述环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)。优选为8：1：4。进一步可选地，所述正内引物FIP和反向内引物BIP的摩尔比为1：1，所述正向外引物F3和反向外引物B3的摩尔比为1：1，所述正向环引物LF和反向环引物LB的摩尔比为1：1。其中，所述核酸染料包括SYBRGreenI、EvaGreen、YOYO、YOPRO、TOTO、TOPRO、SYTO等中的至少一种。这些核酸染料为嵌入型核酸染料，在无双链DNA存在时，所述核酸染料在其溶液中呈游离状态、无荧光或荧光很弱；当存在双链DNA产物扩增，这些核酸染料能与双链DNA结合而报告出强度较大的荧光，且荧光强度随扩增产物的增加而增强，在达到一定阈值时被检测到。本专利技术第二方面提供的所述试剂盒能够对样本中是否含有B族链球菌进行定性检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、速度快等诸多优点。第三方面，本专利技术还提供了一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的方法，包括：提取待测样本的基因，配置扩增反应体系，以待测样本的基因为模板，进行环介导恒温扩增；其中，所述扩增反应体系包括核酸染料、检测B族链球菌的引物组，所述引物组包括内引物对、外引物对和环引物对，其中，所述内引物对包括SEQIDNO：1所示的正向内引物FIP和SEQIDNO：2所示的反向内引物BIP，所述外引物对包括SEQIDNO：3所示的正向外引物F3和SEQIDNO：4所示的反向外引物B3，所述环引物对包括SEQIDNO：5所示的正向环引物LB和SEQIDNO：6所示的反向环引物LB；对所得扩增产物进行实时荧光检测，若检测到所述核酸染料的荧光的强度和增长速度均达到阈值，则判定所述待测样本含有B族链球菌。本专利技术中，若待测样本中存在B族链球菌的基因，则该基因能被不断扩增，其扩增产物的存在会使所述核酸染料报告较强的荧光信号，并随着检测管中扩增产物的增多，荧光信号逐渐增强，荧光信号的变化过程被仪器实时监测。本专利技术在所述核酸染料的荧光强度达到一定阈值及荧光强度的增长速度达到一定阈值时，才判定待测样本为含有B族链球菌的阳性样本，这样既可以排除在不存在所述扩增产物时所述核酸染料的微弱荧光带来的背景干扰，又可以确保所述扩增反应的实时荧光曲线能够即时反映出靶标的存在，增强了对B族链球菌检测结果的准确性。此外，上述阳性判定条件可在荧光监测仪器中预先设定，减少所述检测方法对操作人员的依赖。所述实时荧光检测时，荧光检测通道与所述核酸染料的种类一致，例如为1、2、4等。所述实时荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括内引物对、外引物对和环引物对，其中，所述内引物对包括SEQ ID NO：1所示的正向内引物FIP和SEQ ID NO：2所示的反向内引物BIP，所述外引物对包括SEQ ID NO：3所示的正向外引物F3和SEQ ID NO：4所示的反向外引物B3，所述环引物对包括SEQ ID NO：5所示的正向环引物LF和SEQ IDNO：6所示的反向环引物LB。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括内引物对、外引物对和环引物对，其中，所述内引物对包括SEQIDNO：1所示的正向内引物FIP和SEQIDNO：2所示的反向内引物BIP，所述外引物对包括SEQIDNO：3所示的正向外引物F3和SEQIDNO：4所示的反向外引物B3，所述环引物对包括SEQIDNO：5所示的正向环引物LF和SEQIDNO：6所示的反向环引物LB。


2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述内引物对与所述外引物对、所述环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)。


3.一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸染料和如权利要求1-2任意一项所述的引物组。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲剂、链置换DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和镁盐。


5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内的各成分预先混合形成冻干制剂。


6.一种基于环介导恒温扩增技术检测B族链球菌的方法，其特征在于，包括：
提取待测样本的基因，配置扩增反应体系，以待测样本的基因为模板，进行环介导恒温扩增；其中，所述扩增反应体系包括核酸染料、检测B族链球菌的引物组，所述引物组包括内引物对、外引物对和环引物对，其中，所述内引物对包括SEQIDNO：1所示的正向内引物F...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭媛媛，
申请(专利权)人：深圳麦科田生物医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44