一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用，所述的甲基化分子标志物为甲基化EID3基因，通过测定样本中EID3基因表达及甲基化水平来诊断肺腺癌。本申请首次证实了甲基化EID3基因可作为肺腺癌的诊断标志物，EID3在肺腺癌组织相对癌旁正常肺组织显著高甲基化；甲基化EID3基因在肺腺癌组织中的特异性高表达，为肺腺癌的诊断提供了一种新途径；本申请提供了用于检测甲基化EID3基因的试剂盒，检测准确率高，为肺腺癌的诊断提供了一种更加快速、准确的检测方法。

A methylated molecular marker for the diagnosis of lung adenocarcinoma and its application

【技术实现步骤摘要】
一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用
本专利技术属于生物医学检测
，涉及甲基化EID3作为诊断肺腺癌的分子标志物及制备诊断肺腺癌试剂或试剂盒中的应用。
技术介绍
最新的临床数据显示，肺癌是全球发病率以及致死率最高的恶性肿瘤之一。而肺腺癌是其最常见的病理类型。一项针对我国不吸烟肺腺癌的研究相表明，相对于其他病理类型的肺癌，肺腺癌具有更多的基因变异。此外，肺腺癌病理亚类表现为多样化，这些都给肺腺癌的诊断带来了挑战。低剂量肺CT是目前筛查肺癌的主要手段，使得大量肺腺癌患者在肿瘤发生早期被发现，并且随着手术技术的革新、靶向治疗的进展以及免疫治疗的开展等，肺腺癌患者的预后有了一定的提升，但是肺腺癌患者的总体生存期仍不理想，5年生存率不足20％。寻找新的肺腺癌诊断靶点迫在眉睫。在众多的基因修饰方式中，最常见的为基因的甲基化修饰，而以往基因组学的研究着重于基因序列的改变，随着表观遗传学的发展，研究者们发现，不仅仅是基因的序列，其修饰也可从亲代遗传到下一代。TCGA数据库作为目前容量最大的公用数据库之一，为我们提供了一个筛选新型靶点的好方法。本专利技术人利用TCGA中肺腺癌基因表达及基因甲基化数据库，评估了肺腺癌中肿瘤及癌旁组织存在差异甲基化的基因，将其基因表达与甲基化水平相联系，并且从中选择差异显著的基因－EID3做进一步研究。EID家族共有3个成员：EID1、EID2以及EID3。其中，EID3可直接影响甲基转移酶家族成员DNMT3A，该酶具有双甲基化和去甲基化能力。从而我们认为EID3基因的甲基化可能对肺腺癌的发生发展产生一定的影响。研究表明，在乳腺癌细胞中EID3表达的上调可诱导细胞衰老，并增加乳腺癌细胞对放化疗的敏感性。血清中的EID3抗体可作为预测胰腺神经内分泌肿瘤复发的生物学标志物。目前，肺腺癌中EID3基因及其甲基化的影响尚未有报道。并且尚未有用于检测EID3基因表达及甲基化在组织中表达情况的完整试剂盒。
技术实现思路
为了解决以上现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于从TCGA数据库中进行筛选并使用本单位样本进行验证，提供一种诊断肺腺癌的甲基化基因标志物，本专利技术的另一目的在于提供检测EID3基因表达及甲基化诊断试剂盒中的应用。本专利技术分析了TCGA数据库以及来自复旦大学附属华东医院的肺腺癌队列。本专利技术在TCGA甲基化数据库基础上，揭示了肺腺癌组织及癌旁正常肺组织具有显著甲基化差异的基因(图1)。本专利技术在华东医院验证样本中，设计了EID3基因甲基化测序特异性引物(图2)，测序结果表明EID3在肺腺癌组织相对癌旁正常肺组织显著高甲基化(图3)，在所检测的甲基化位点中，除194、204、208位点以外，其他位点甲基化水平相对较低。所有位点在T组中甲基化均显著高于N组(图4)。本专利技术的主要技术方案如下：一种甲基化分子标志物在制备肺腺癌诊断产品中的应用，所述的甲基化分子标志物为甲基化EID3基因。进一步的，所述诊断产品通过测定样本中EID3基因表达及甲基化水平来诊断肺腺癌。进一步的，所述的样本为肺腺癌组织。一种用于诊断肺腺癌的检测试剂盒，所述试剂盒用于检测甲基化EID3基因。进一步的，所述的试剂盒中包含检测甲基化EID3基因的引物对，所述引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。Leftprimer(SEQIDNO.1)：GAGGYGTTYGTTTATAGATT；Rightprimer(SEQIDNO.2)：TACAATCCAACCAAATTTAATTCAC。所述试剂盒中除特异性引物外，还包括，PCR反应液由SYBRGreen染料、dNTP、Mg2+、DTT、反转录酶和Buffer等组成。PCR反应液中各组分和用量对所属领域技术人员而言是公知常识。体外检测肺腺癌组织中EID3的甲基化差异，首先是检测待测组织及癌旁肺组织中EID3的甲基化水平，其次对两组样本中EID3甲基化水平进行比较，最后判断这种核酸分子标志物在待测肺腺癌组织中是否均存在高甲基化修饰。有益效果：本专利技术提供了一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用，其有益效果主要体现在以下几个方面：1、本申请首次证实了甲基化EID3基因可作为肺腺癌的诊断标志物，EID3在肺腺癌组织相对癌旁正常肺组织显著高甲基化，表明甲基化EID3基因可以作为肺腺癌的诊断标志物；2、甲基化EID3基因在肺腺癌组织中的特异性高表达，为肺腺癌的诊断提供了一种新途径；3、本申请提供了用于检测甲基化EID3基因的试剂盒，检测准确率高，为肺腺癌的诊断提供了一种更加快速、准确的检测方法。附图说明图1为TCGA数据库中肺腺癌及癌旁肺组织中甲基化差异最大的前100个基因热图。图2为EID3甲基化引物设计区域图。图3为华东医院肺腺癌及癌旁肺组织EID3基因甲基化检测结果图，T代表肺腺癌组织，N代表癌旁肺组织。图4为华东医院肺腺癌及癌旁肺组织EID3基因各个甲基化位点甲基化水平检测结果图，T代表肺腺癌组织，N代表癌旁肺组织；*代表p值＜0.05。图5为EID3基因位点树状聚类图；每个样本为一行；位点甲基化水平用不同颜色方块代表。具体实施方式现结合实施例和附图，对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的实施并不仅限于此，所述实施例仅仅是帮助理解本专利技术，不应视为对本专利技术的具体限制。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。实施例1TCGA甲基化数据库研究1.数据下载：TCGA肺腺癌甲基化数据库下载于TCGA数据库官网，网址为https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/，搜索关键词为lungadenocarcinoma以及DNAmethylation。数据下载日期为2019-03-27。所有数据均经过标准化处理，DNA甲基化队列的总样本量为616(53个正常，563个肺腺癌)。2.数据处理：(1)所有数据在进行进一步分析之前均经过标准化处理。(2)卡方检验用于分析基因甲基化在肺腺癌及癌旁肺组织中的差异。(3)差异甲基化基因使用p＝0.05以及|logFc|＝0.5为标准筛选。(4)TCGA数据下载软件为Perl，数据处理及分析所使用软件为R，版本号为3.3.1。3.数据分析结果：在本专利技术中，TCGA组基因甲基化队列共纳入616例样本信息，其中肺腺癌563例，对照53例。我们使用p值<0.05以及|LogFC|>0.5进行筛选，发现在已有甲基化数据的20204个基因中，共2084个基因在肺腺癌组织与癌旁组织中存在差异甲基化，其中肿瘤组织相对癌旁组织高甲基化的有369个，相对低甲基化的有1715个。我们展示了差异甲基化倍数前100的基因所构成的热图(图1)。实施例2组织EID3甲基化水平定量研究1.研究对象：<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲基化分子标志物在制备肺腺癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述的甲基化分子标志物为甲基化EID3基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种甲基化分子标志物在制备肺腺癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述的甲基化分子标志物为甲基化EID3基因。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断产品通过测定样本中EID3基因表达及甲基化水平来诊断肺腺癌。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的样本为肺腺癌组...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡牧宇，张辉标，孙艺华，周子琅，肖健，曹佳实，
申请(专利权)人：华东医院，
类型：发明
国别省市：上海;31