坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法技术

本发明专利技术公开了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNA Marker DL 2000，30μL的引物lktA‑F，30μL的引物lktA‑R，引物lktA‑F和引物lktA‑R的浓度为10μM，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照；通过对PCR反应条件优化，研制出了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，通过PCR检测结果与阳性对照和阴性对照比较，证明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒可以准确快速检测到样品中是否含有坏死杆菌白细胞毒素，并且使用本试剂盒检测具有操作简单，反应灵敏，结果准确的特点。

PCR diagnostic kit of necrotoxin gene and its establishment

【技术实现步骤摘要】
坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法
本专利技术涉一种诊断试剂盒，具体涉及坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法。
技术介绍
腐蹄病(Footrot)是由坏死杆菌所导致的能够严重影响动物生产的疾病，作为奶牛三大疾病之一，腐蹄病在我国发病率较高，患该病严重的牛场发病率可达30％-40％，是高度接触性传染病。引发奶牛腐蹄病的因素有很多，当奶牛精饲料比例过高、粗纤维摄入量不足时，导致反刍功能下降，进而引起奶牛瘤胃pH值降低和瘤胃生理机能紊乱，引发瘤胃内的微生物产生过多的内毒素，致使奶牛抵抗力下降；奶牛蹄部在粪污中被泡软时，易导致牛蹄被尖锐物体刺入，以至于在伤口深部产生厌氧环境，厌氧菌在此大量繁殖，菌体产生的毒素会危害机体，导致奶牛腐蹄病。患病奶牛蹄部出现红肿糜烂、软组织增生、脓液流出、组织坏死，并且散发恶臭，严重者出现蹄壳脱落的现象，从而造成体温升高、喜卧、精神沉郁、食欲降低等全身症状，以及支跛、四肢交替负重、疼痛跛行等局部症状，这些症状会致使奶牛生产性能下降，患病严重奶牛会被提前淘汰，造成重大的经济损失。坏死杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)是革兰氏阴性、专性厌氧多形态杆菌，坏死杆菌包含两个亚种，Fnn和Fnf，Fnn感染家畜为主，而Fnf感染人为主，二者都具有非常强的致病性，均广泛存在于自然界中，在动物口腔、胃肠道等均可分离得到，坏死杆菌属于条件性致病菌，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。坏死杆菌生长条件苛刻，需在培养基中添加血液、葡萄糖、肝块或者脑块等营养物质；坏死杆菌常引起皮肤、皮下组织坏死性病变，如腐蹄病、坏死性皮炎、坏死性口炎等；动物机体处于健康状态下，坏死杆菌无法侵入，只有当组织出现蹄部浸软、外伤和微生物感染的前提下，才能在蹄部组织深部大量繁殖；多数情况下坏死杆菌会和节瘤拟杆菌混合侵入奶牛蹄部，此种情况下病情更加严重；坏死杆菌能产生多种毒力因子，白细胞毒素(Leukotoxin)、溶血素、溶胶原蛋白、血凝素、内毒素、血小板凝集素、血小板凝集素；这些毒力因子可以逃避宿主天然免疫屏障，为菌体入侵机体创造条件；其中白细胞毒素是坏死杆菌的主要毒力因子，是细胞外泌的蛋白质；白细胞毒素能对牛羊等反刍兽的白细胞和马的多形核细胞产生毒害作用，而对兔、猪的白细胞没有毒害作用；白细胞毒素对中性粒细胞具有吞噬作用，其释放的产物会对肝细胞造成一定的损伤，能够直接降低肝细胞的防御作用，造成肝实质损伤，从而导致肝脓肿。白细胞毒素可以作为免疫原，在坏死杆菌培养物的上清液中可大量获得，给牛注射培养物的上清液可大大降低牛患腐蹄病概率。现阶段关于坏死杆菌引起的腐蹄病的PCR检测方法特异性不高，缺少能对临床样品中坏死杆菌毒力基因进行简单、快速、便捷、准确的试剂盒；进行PCR检测后，仍需做进一步的革兰氏染色鉴定，由于感染动物的坏死杆菌白细胞毒素lktA基因十分保守，且坏死杆菌白细胞毒素lktA基因序列具有特异性和很高的同源性；目前坏死杆菌引起的腐蹄病的PCR检测方法特异性不高，缺少能对临床样品中坏死杆菌白细胞毒素毒力基因进行简单、快速、便捷、准确的试剂盒。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术旨在提供坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，通过对PCR反应条件进行优化，研制出了检测坏死杆菌白细胞毒素基因PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照和阳性对照比较，证明其可以起到快速检测到是否有坏死杆菌白细胞毒素基因的作用，而且具有检测结果准确，具有操作快捷、灵敏，检测方式简单，特异性强，使用效果好的特点。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，包括30μL的上游引物lktA-F和30μL的下游引物lktA-R的，所述上游引物lktA-F与下游引物lktA-R的序列分别为：lktA-F：5'GGGTAAGACCAAATGAGC3'；lktA-R：5'CCATTACCACTATCCCCC3'。进一步的，所述的试剂盒还包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNAMarkerDL2000，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照，所述上游引物lktA-F和下游引物lktA-R的浓度为10μM。进一步的，所述的阴性对照为去离子水；所述的阳性对照为坏死杆菌A25菌基因组DNA。坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法包括以下步骤：步骤一：培养坏死杆菌A25菌将A25菌加入苛氧厌氧液体培养基中进行培养备用；步骤二：细菌革兰氏染色鉴定对步骤一培养的每代细菌需要进行细菌革兰氏染色鉴定，将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定，使用革兰氏染液染色；步骤三：提取细菌基因组选取5mL步骤一培养的活力在最好状态的坏死杆菌A25的菌液，进行离心、洗涤后，运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养备用的细菌的细菌基因组；步骤四：设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物依据已经提交于GenBank上的坏死杆菌A25菌株白细胞毒素的核苷酸序列在NCBI上进行设计，利用Primer-BLAST方法设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA的引物，将所选的引物进行合成，设计出上游引物lktA-F和下游引物lktA-R；步骤五：PCR方法的建立设计出坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物后，经过实验，设计最佳反应温度，以步骤三提取的坏死杆菌A25菌株的基因组为模板，用lktA引物对基因组进行PCR扩增；步骤六：利用阴性对照及阳性对照的结果证明，用引物均可以扩增出其目的条带，目的条带片段大小为1700bp，无非特异性片段产生，结果表明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR检测方法建立成功。进一步的，步骤一所述的培养坏死杆菌A25菌的具体步骤为：S1.将A25菌以1:100的比例加入苛氧厌氧液体培养基中，在厌氧培养箱中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，当菌液变为乳白色均一浑浊液为宜；S2.将所述乳白色均一浑浊的菌液继续以1:100的比例接种于苛氧厌氧液体培养基中，进行传代培养；S3.传代培养3-4代，使细菌活力达到最好状态备用。进一步的，步骤二所述的细菌革兰氏染色鉴定的具体步骤包括：S1.将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定；S2.首先将Ⅰ号结晶紫染色液加在已被固定的细菌载玻片上，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；S3.然后在细菌载玻片上再滴加Ⅱ号革兰氏碘液，染色1min后，用蒸馏水缓慢冲洗剩余染色液；S4.随后滴加Ⅲ号95％酒精液到细菌载玻片上，夏季脱色30s，冬季脱色1min；S5.最后使用Ⅳ号沙黄染色液对细菌载玻片染色1min，用滤纸吸干载玻片上水分，在显微镜下观察，观察时使用显微镜油镜观察革兰氏染色的坏死杆菌A25菌株。...

【技术保护点】
1.坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括30μL的上游引物lktA-F和30μL的下游引物lktA-R的，所述上游引物lktA-F与下游引物lktA-R的序列分别为：/nlktA-F：5'GGGTAAGACCAAATGAGC 3'；/nlktA-R：5'CCATTACCACTATCCCCC 3'。/n

【技术特征摘要】
1.坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，其特征在于，包括30μL的上游引物lktA-F和30μL的下游引物lktA-R的，所述上游引物lktA-F与下游引物lktA-R的序列分别为：
lktA-F：5'GGGTAAGACCAAATGAGC3'；
lktA-R：5'CCATTACCACTATCCCCC3'。


2.根据权利要求1所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNAMarkerDL2000，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照，所述上游引物lktA-F和下游引物lktA-R的浓度为10μM。


3.根据权利要求2所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为去离子水；所述的阳性对照为坏死杆菌A25菌基因组DNA。


4.根据权利要求2所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，所述的PCR诊断试剂盒的建立方法包括以下步骤：
步骤一：培养坏死杆菌A25菌
将A25菌加入苛氧厌氧液体培养基中进行培养备用；
步骤二：细菌革兰氏染色鉴定
对步骤一培养的每代细菌需要进行细菌革兰氏染色鉴定，将细菌菌液取2.5μL直接涂于载玻片，酒精灯外焰固定，使用革兰氏染液染色；
步骤三：提取细菌基因组
选取5mL步骤一培养的活力在最好状态的坏死杆菌A25的菌液，进行离心、洗涤后，运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养备用的细菌的细菌基因组；
步骤四：设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物
依据已经提交于GenBank上的坏死杆菌A25菌株白细胞毒素的核苷酸序列在NCBI上进行设计，利用Primer-BLAST方法设计坏死杆菌白细胞毒素基因lktA的引物，将所选的引物进行合成，设计出上游引物lktA-F和下游引物lktA-R；
步骤五：PCR方法的建立
设计出坏死杆菌白细胞毒素基因lktA-F和lktA-R引物后，经过实验，设计最佳反应温度，以步骤三提取的坏死杆菌A25菌株的基因组为模板，用lktA引物对基因组进行PCR扩增；
步骤六：利用阴性对照及阳性对照的结果证明，用引物均可以扩增出其目的条带，目的条带片段大小为1700bp，无非特异性片段产生，结果表明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR检测方法建立成功。


5.根据权利要求4所述的坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒的建立方法，其特征在于，步骤一所述的培养坏死杆菌A25菌的具体步骤为：
S1.将A25菌以1:100的比例加入苛氧厌氧液体培养基中，在厌氧培养箱中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h-48h，当菌液变为乳白色均一浑浊液为宜；
S2.将所述乳白色均一浑浊的菌液继续以1:100的比例接种于苛氧厌氧液体培养基中，进行传代培养；
S3.传代培养3-4代，使细菌活力达到最好状态备用。


6.根据权利要求4所述的坏死杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东波，郭东华，李赫，蒋剑成，贺显晶，王志慧，张思瑶，肖佳薇，汪锋锋，王丽娜，丁梦圆，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23