一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域；所述引物组包括上游引物和下游引物。利用本发明专利技术的引物组对布鲁氏菌进行RPA扩增，结合SYBR Green I可对布鲁氏菌进行现场可视化检测，本发明专利技术不依赖PCR仪等热循环仪器，利用RPA技术对布鲁氏菌核酸进行扩增，扩增结束后使用395nm波长的紫外灯进行照射，观察反应体系是否呈现荧光判定检测结果，本发明专利技术的引物组具有特异性强、敏感性好，所发明专利技术的试剂盒操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为布鲁氏菌的现场可视化检测提供新的方法。

A primer set, visual detection kit and its application for RPA amplification of Brucella

【技术实现步骤摘要】
一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用。
技术介绍
布鲁氏菌(Brucella)又称布氏杆菌，是一种革兰氏阴性的不运动细菌，可以在牛、羊、猪等多种家畜体内存活。目前我国对布鲁氏菌的检测主要以细菌学、血清学检测方法为主，这些方法存在着费时费力，假阳性等缺点。随着分子生物学技术的发展，PCR方法逐步用于布鲁氏菌的鉴定。但PCR技术本身存在依赖PCR仪、易污染、灵敏度和特异性有待于进一步提高等问题，而且扩增产物需要经过进一步琼脂糖凝胶电泳或荧光定量检测等设备才能得到检测结果，不能实现布鲁氏菌的可视化检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用，本专利技术的方法具有特异性强、灵敏度高、能够可视化检测的优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了一种包括上述方案所述引物组的试剂盒。优选的，所述试剂盒还包括醋酸镁水溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、50×SYBRGreenI和无菌水。优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品包括布鲁氏菌的基因组DNA；所述阴性对照品包括无菌水。本专利技术提供了上述方案所述引物组或者所述试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌RPA扩增中的应用，所述应用包括以下步骤：1)提取待检测样品的基因组DNA；2)以待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；3)将所述RPA扩增产物和50×SYBRGreenI混合，离心，用395nm波长的紫外灯照射，观察扩增产物的产生荧光情况，若扩增产物呈现荧光，则样品中含有布鲁氏菌，若扩增产物不呈现荧光，则样品中不含布鲁氏菌。优选的，步骤2)中还包括分别以布鲁氏菌的基因组DNA和无菌水为模板进行RPA扩增；所述以布鲁氏菌的基因组DNA为模板的RPA扩增结果作为阳性对照，以无菌水为模板的RPA扩增结果作为阴性对照。优选的，步骤2)中所述RPA扩增反应的反应体系以50μL计包括：2μL模板、12.4μL无菌水、29.5μLRPA反应缓冲液、上下游引物各1.8μL，2.5μL醋酸镁水溶液和4mgRPABasic冻干粉；所述醋酸镁水溶液中醋酸镁的浓度为280mM；所述上游引物和下游引物的浓度分别为10μM；所述模板的浓度为0.1μg/μL。优选的，步骤2)中所述RPA扩增反应的程序为：37～42℃扩增10～20min。优选的，以RPA扩增的扩增体系为50μL计，步骤3)中所述50×SYBRGreenI的用量为1～2μL。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物。利用本专利技术的引物组对布鲁氏菌进行RPA扩增，结合SYBRGreenI可对布鲁氏菌进行现场可视化检测，本专利技术不依赖PCR仪等热循环仪器，利用RPA技术对布鲁氏菌核酸进行扩增，扩增结束后，不需要进行琼脂糖凝胶电泳分析，只使用395nm波长的紫外灯进行照射，观察反应体系扩增产物是否呈现荧光，就可以判定检测结果，本专利技术的引物组具有特异性强、敏感性好，所专利技术的试剂盒操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为布鲁氏菌的现场可视化检测提供新方法。附图说明图1为实施例1和对比例1～5的不同引物组RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中1为对比例1的引物扩增产物、2为对比例2的引物扩增产物、3为对比例3的引物扩增产物、4为实施例1的引物扩增产物、5为对比例4的引物扩增产物、6为对比例5的引物扩增产物、M为Marker；图2为实施例2中以布鲁氏菌基因组DNA为模板，不同扩增反应温度的RPA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1为37℃扩增产物、2为38℃扩增产物、3为39℃扩增产物、4为40℃扩增产物、5为41℃扩增产物、6为42℃扩增产物、M为Marker；图3为实施例3中不同引物浓度和不同RPA扩增反应时间的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中图3中的A为不同引物浓度的RPA体系扩增10min对应扩增情况，图3中的B为不同引物浓度的RPA体系扩增15min对应扩增情况，图3中的C为不同引物浓度的RPA体系扩增20min对应扩增情况；图4为实施例4中不同菌种的RPA反应特异性分析的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1为布鲁氏菌基因组扩增产物，2为大肠杆菌基因组扩增产物，3为沙门氏菌基因组扩增产物，4为小肠结肠炎耶氏菌基因组扩增产物，5为副溶血弧菌基因组扩增产物，6为福氏志贺氏菌基因组扩增产物，7为无菌水；图5为实施例5中RPA反应灵敏度分析的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1～9为:布鲁氏菌基因组浓度141.358ng/μL～1.41358×10-6ng/μL；图6为实施例6中RPA反应重复性分析扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1～3为布鲁氏菌基因组扩增产物；图7为实施例6中人工加标血清样品灵敏度检测结果，其中1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/mL～2.14×101CFU/mL；图8为实施例6中人工加标血清样品检测重复性分析结果，其中图8中A的1～10:10个加标样，图8中B的11:阴性对照；图9为实施例6中人工加标牛肉样品灵敏度检测结果，其中1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/g～2.14×101CFU/g；图10为实施例6中人工加标牛肉样品检测重复性分析结果，其中图10中A的1～10:10个加标样，图10中B的11:阴性对照；图11为实施例6中人工加标牛奶样品灵敏度检测结果，其中1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/mL～2.14×101CFU/mL；图12为实施例6中人工加标牛奶样品检测重复性分析结果，其中图12中A的1～10:10个加标样，图12中B的11:阴性对照。具体实施方式本专利技术提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：CCTTTCAGGTCTGCGACCGATTTGATGTTT；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：ATATCAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGG；所述上游引物和下游引物由长春库美生物科技有限公司合成。本专利技术中，所述引物组针对布鲁氏菌属的外膜蛋白31(Brucellacellsurfaceprotein31ku，BCSP31)基因设计得到，该基因高度保守一致，存在于所有不同种布鲁氏菌的基因组中；所述外膜蛋白31基因序列参考本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种包括权利要求1所述引物组的试剂盒。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、50×SYBRGreenI和无菌水。


4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品包括布鲁氏菌的基因组DNA；所述阴性对照品包括无菌水。


5.权利要求1所述引物组或者权利要求2～4任意一项所述试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌RPA扩增中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以待检测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；
3)将所述RPA扩增产物和50×SYBRGreenI混合，离心，用395nm波长的紫外灯照射，观察反应体系扩增产物产生荧光情况，若反应体...

【专利技术属性】
技术研发人员：任洪林，张士军，柳溪林，张英，胡盼，卢士英，柳增善，李岩松，祝万菊，闫守庆，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22