ant(3″)-Ia基因的LAMP试剂盒及其专用引物制造技术

本发明专利技术公开了用于检测ant(3″)‑Ia基因的LAMP试剂盒及其专用引物。用于对ant(3″)‑Ia基因进行LAMP检测的引物是根据ant(3″)‑Ia基因特异性的保守靶序列设计的，用以定性检测纯菌、痰液、尿液、粪便样品中的ant(3″)‑Ia基因。所述用于对ant(3″)‑Ia基因进行LAMP检测的六条引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明专利技术可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到ant(3″)‑Ia基因，不需要复杂仪器，最低检测极限均可达100fg/μL，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
ant(3″)-Ia基因的LAMP试剂盒及其专用引物
本专利技术涉及分子检测领域，属于细菌耐药基因检测技术，特别涉及用于检测ant(3″)-Ia基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
ant(3″)-Ia基因(aminoglycoside-3″-adenyltransferase)又名aadA，aadA1，aad(3″)(9)，首次于1985年被hollingshead和vapnek报道。普遍存在于肠杆菌科，鲍曼氏杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌等革兰氏阴性细菌中，是一种最常见的一种氨基糖苷类抗生素的耐药基因。其作用机制是利用ATP作为第二底物，通过将AMP转移到3″位羟基，从而使抗生素与核糖体结合不紧密，导致抗生素不能进入下一阶段发挥抗菌作用，使细菌在抗生素存在的情况下仍能存活。主要修饰的氨基糖苷类抗生素为大观霉素和链霉素。在细菌的DNA中，ant(3″)-Ia基因常常通常以基因盒的形式存在，是大量整合子、质粒和转座子的一部分。它们或者常被发现与其他抗性酶融合，例如插入IS26；或者是众多转座子的一部分，如：广泛传播的tn21和其他被称为tn21亚家族的相关转座子、TN1331、含有2类整合子的TN7。自氨基糖苷类抗生素问世以来，以其优良的抗菌活性、谱广性和较长时间的抗生素后效应得到临床的亲睐，但是近年来由于抗生素不合理使用，越来越多的细菌产生了耐药性，甚至是多重耐药性，给临床治疗带来了新的问题。对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等革兰氏阴性细菌进行耐药基因的调查，其中常能发现ant(3″)-Ia基因。彭敬红(彭敬红，侯彦强，谢多双，刘军，郑蓉，铜绿假单胞菌16SrRNA甲基化酶基因和氨基糖苷修饰酶基因的研究，检验医学[J]，2015，30(6)：613-616)对十堰市某三甲医院临床分离的35株氨基糖苷类耐药的铜绿假单胞菌进的基因检测，发现ant(3″)-Ia的基因阳性率为51.4％(18株)。张凡(张凡，郭普，张伦军，郑晶，郑照军，徐元宏，铜绿假单胞菌氨基糖苷类抗生素耐药基因检测，安徽医科大学学报[J]，2018，53(6)：928-932)对蚌埠医学院第一附属医院于2016年1～12月临床分离的248株铜绿假单胞菌进行了耐药基因检测，发现有54株为氨基糖类抗生素耐药菌株，其中ant(3″)-Ia的基因阳性率为66.7％(36株)。卓启芳(卓启芳，耐氨基糖普类抗菌药物的鲍曼不动杆菌氨基糖普酶和16SrRNA甲基化酶基因的检测[D]，天津医科大学，天津医科大学，2013)对天津医科大学第二医院呼吸科2010年1月-2011年12月临床分离的136株鲍曼不动杆菌共进行了耐药基因的检测，发现有32株为氨基糖苷类抗生素耐药菌株，其中ant(3″)-Ia的基因阳性率为90.6％(29株)。沙代提古力·米吉(沙代提古力·米吉提，乌鲁木齐地区鲍曼不动杆菌耐药分析及氨基糖苷类修饰酶基因型的研究[D]，新疆医科大学，新疆医科大学，2018)对乌鲁木齐地区734鲍曼不动杆菌进行氨基糖苷类耐药基因检测，发现有35株氨基糖苷类耐药菌株，其中ant(3″)-Ia的基因阳性率为100％。现有的检测方法，一般只是通过药敏实验来判定微生物是否对某一种抗生素具有耐药性，该法费时，操作繁琐。环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是日本学者Notomi于2000年在NucleicAcidsRes杂志上公布的一种新型适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。该技术依赖4条或6条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测ant(3″)-Ia基因的LAMP检测引物和试剂盒。本专利技术的技术方案包括：一种用于检测ant(3″)-Ia基因的环介导等温核酸扩增引物组合，其特征在于：其序列如SEQIDNO：1～6所示。一种用于检测ant(3″)-Ia基因的环介导等温核酸扩增试剂盒，其特征在于：它包括序列如SEQIDNO：1～6所示的引物。如前述的试剂盒，它还包括：1)反应缓冲液；2)DNABst聚合酶；所述反应缓冲液包括如下配比的组分：40摩尔份的Tris-HCl、50摩尔份的KCl、16摩尔份的MgSO4、20摩尔份的(NH4)2SO4、1600摩尔份的甜菜碱、0.2体积份的Tween-20；当体积份为L时，摩尔份为mmol。如前述的试剂盒，所述试剂盒中的缓冲液还含有dNTPs。如前述的试剂盒，所述dNTPs中包括2.8摩尔份的dATP、dGTP、dTTP和dCTP。如前述的试剂盒，它还包括：含有ant(3″)-Ia基因的DNA，作为阳性对照。如前述的试剂盒，所述反应缓冲液为2倍浓度母液(即溶质浓度为工作浓度的2倍，又称“2×反应缓冲液”)，其中含有：40mMTris-HCl，50mMKCl，20mM(NH4)2SO4，0.1％Tween-20，1.6M甜菜碱，16mMMgSO4，2.8mMdATP、2.8mMdGTP、2.8mMdTTP和2.8mMdCTP，80μMSEQIDNO：1，80μMSEQIDNO：2所示引物，10μMSEQIDNO：3，10μMSEQIDNO：4所示引物，20μMSEQIDNO：5，20μMSEQIDNO：6所示引物。前述的2倍浓度母液也可以依照比例配成其它倍数浓度的母液，例如：将其中溶质浓度提高2.5倍，得到5倍浓度母液。不同倍数浓度的母液只要溶质比例与本专利技术相同，均为本专利技术构思的常规替代方式。本专利技术还提供了一种检测ant(3″)-Ia基因的环介导等温核酸扩增方法，它是使用前述试剂盒进行环介导等温核酸扩增检测的方法。如前述的方法，它包括如下步骤：A.1μL待检基因组模板DNA、1μLBstDNA聚合酶、LAMP引物组、缓冲液混匀，加水补充成25μL体系；B.于恒温金属浴上65℃放置1小时；C.将金属浴调到80℃中止反应，20min后取出；步骤A中所述体系中含有20mMTris-HCl，25mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween-20，0.8M甜菜碱，8mMMgSO4，1.4mMdATP、1.4mMdGTP、1.4mMdTTP和1.4mMdCTP，0.32UBstDNA聚合酶(BstDNApolymerase)，40μMSEQIDNO：1，40μMSEQIDNO：2所示引物，5μMSEQIDNO：3，5μMSEQIDNO：4所示引物，10μMSEQIDNO：5，10μMSEQIDNO：6所示引物。如前述的方法，它还包括：使用电泳来显示扩增结果。如前述的方法，它还包括：使用电泳和/或荧光染料来显示扩增结果；优选地，所述荧光染料为GreenI。本专利技术的引物组合以及LAMP检测试剂盒，具有极高的特异性，能有效检测ant(3″)-Ia基因，而对Kpc-2基因、armA基因、tetA基因、Tem基因、Shv基因、Ctx-m-16基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测ant(3″)-Ia基因的环介导等温核酸扩增引物组合，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：1～6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测ant(3″)-Ia基因的环介导等温核酸扩增引物组合，其特征在于：其序列如SEQIDNO：1～6所示。


2.一种用于检测ant(3″)-Ia基因的环介导等温核酸扩增试剂盒，其特征在于：它包括序列如SEQIDNO：1～6所示的引物。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，它还包括：
1)反应缓冲液；
2)DNABst聚合酶；
所述反应缓冲液包括如下配比的组分：
40摩尔份的Tris-HCl、50摩尔份的KCl、16摩尔份的MgSO4、20摩尔份的(NH4)2SO4、1600摩尔份的甜菜碱、0.2体积份的Tween-20；
当体积份为L时，摩尔份为mmol。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的缓冲液还含有dNTPs。


5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述dNTPs中包括2.8摩尔份的dATP、dGTP、dTTP和dCTP。


6.如权利要求2～5任一所述的试剂盒，其特征在于，它还包括：
含有ant(3″)-Ia基因的DNA，作为阳性对照。


7.如权利要求2～6任一所述的试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液为2倍浓度母液，其中含有：40mMTris-HCl，50mMKCl，20mM(NH4)2SO4，0.1％Tween-20，1.6M甜菜碱，16mMMgSO4，2.8mMdATP、2.8mMd...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓珊珊，贾旭，
申请(专利权)人：成都医学院，
类型：发明
国别省市：四川;51