梨糖转运基因PbSWEET4及其应用制造技术

本发明专利技术公开了梨糖转运基因PbSWEET4及其重组表达载体的应用。一种分离自砀山酥梨具有糖外排功能的结构基因PbSWEET4，该基因的核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。将本发明专利技术所述的基因PbSWEET4转化到二倍体森林草莓并进行功能验证，以野生型草莓作为对照，获得的转基因草莓植株叶片蔗糖含量显著降低，并且叶片呈现出早衰的现象。表明本发明专利技术所克隆的PbSWEET4基因是编码糖转运蛋白的功能结构基因，具有外排可溶性糖的功能，在叶片糖积累中起负调控作用，同时还参与调控叶片的衰老进程。

The pear sugar transporter gene pbsweet4 and its application

【技术实现步骤摘要】
梨糖转运基因PbSWEET4及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，涉及梨糖转运基因PbSWEET4及其重组表达载体和应用。具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个参与梨糖转运相关的SWEEET家族成员PbSWEET4基因及其应用。
技术介绍
梨(Pyrus)是蔷薇科(Rosaceae)梨属(PyrusL.)多年生落叶果树，在世界范围内广泛种植，具有重要的经济和社会价值。梨果实的食用品质是决定其价值的重要因素,因此提高梨的食用品质具有重要的意义。梨果实食用品质受诸多因素影响,其中糖是果实品质构成的重要指标之一，提高梨果实的糖含量,对梨品质改善至关重要。近年来,我国梨的主栽品种由于品种退化或是管理不善等原因,出现果实含糖量下降、风味变淡等问题，严重影响果实品质和经济价值。因此,梨果实糖含量的品质改良已经成为现代梨育种的重要目标之一。然而在梨果实糖含量的研究大多集中在不同梨品种糖含量的评估上，对于糖相关基因的功能研究亟待加强。糖首先由叶片通过光合作用合成，然后通过韧皮部以共质体途径或质外体途径运输至库中(Oparka,1990)。叶片作为植物产生糖的主要场所，对多数植物的生长必不可少。叶片衰老是叶片发育的最后阶段，也是落叶果树生命周期的重要组成部分。该过程涉及一系列有序的变化，包括大分子(例如蛋白质)降解、营养物质向活跃生长的器官(如嫩叶，发育中的种子和果实)的运输等。叶片衰老决定果实的产量和品质。如果衰老发生得过早，则植物吸收CO2的总能力会降低，最终导致光合效率下降(Wingleretal.,2006)。反之，则衰老相关的养分循环就会受到抑制(HimelblauandAmasino,2001)，这对于果实的发育具有重要影响。在拟南芥中，抑制AtTOR(雷帕霉素靶蛋白)和SID2(缺失水杨酸合成酶基因)的表达导致叶片早衰且减少了种子的产量，而过表达NahG(表达水杨酸羟化酶并能够水解水杨酸)的转基因植株也表现为叶片衰老和种子减产(Deprostetal.,2007；AbreuandMunne-Bosch,2009)。另外，过表达SlNAP2(NAC基因家族促进衰老基因)的转基因番茄植株呈现叶片早衰，进而导致果实产量和可溶性糖含量下降(Maetal.,2018)。RNA干扰INVINH1(转化酶抑制剂)转基因番茄中细胞壁转化酶活性升高，延迟了叶片衰老，同时提高了种子重量和糖含量(Jinetal.,2009)。综上，叶片发育对于果实的产量和品质至关重要。然而，目前有关叶片衰老对果实品质影响的调控机制研究还比较欠缺。因此，进一步探讨叶片衰老与糖代谢的关系，对揭示叶片衰老对果实品质影响的机制、改善梨果实品质具有重要的理论和现实意义。众所周知，糖可以参与信号转导、维持渗透压、组成碳骨架，或者以特定形式贮存在果实中。除此之外，糖还在逆境胁迫中起着重要作用。糖含量由合成、降解、转运和贮存等过程共同决定,其中转运是较为关键的过程(Katzetal.,2007)。目前，已经发现三类真核生物的糖转运蛋白，分别是：葡萄糖转运蛋白(GLUT)，钠葡萄糖转运蛋白(SGLTs)和SWEETs(Chenetal.,2015)，其中SWEET是一类新发现的糖转运蛋白。目前尚未见梨中SWEET功能的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种具有糖外排和促进衰老功能SWEET基因。本专利技术的另一目的是提供该基因的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种分离自梨具有糖外排功能的结构基因PbSWEET4，属于SWEET基因家族。该基因的核酸序列如序列表SEQIDNo.1所示，包含918bp的开放阅读框；编码305个氨基酸，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示，等电点为7.17，分子量为34.2KDa。含有本专利技术所述PbSWEET4基因的重组表达载体。所述的重组表达载体，优选以pMDC32为出发的载体，将权力要求1所述基因PbSWEET4通过Gateway反应插入pMDC32所得。含有本专利技术所述PbSWEET4基因的宿主菌。克隆本专利技术所述PbSWEET4基因cDNA序列的引物对，上游引物PbSWEET4-F1序列如SEQIDNo.3所示，下游引物PbSWEET4-R1序列如SEQIDNo.4所示。本专利技术所述PbSWEET4的重组表达载体在促进梨叶片糖外排和衰老中的应用。所述的应用，构建所述的梨糖转运基因PbSWEET4的植物超表达载体并转化二倍体森林草莓，以野生型草莓作为对照，获得的转基因草莓植株叶片蔗糖含量显著降低，并且叶片呈现出早衰的现象。有益效果与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和效果：1.PbSWEET4基因的发现，为促进梨糖分转运的分子育种和实现绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现农业友好。2.本专利技术构建PbSWEET4基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将梨PbSWEET4基因转化二倍体草莓，获得的转基因植株经生物学功能分析，表明本专利技术克隆的PbSWEET4基因促进草莓叶片糖的外排，同时促进叶片衰老。通过对该基因的超表达或，可以起到调节转基因植物叶片可溶性糖和衰老的作用。附图说明：图1为本专利技术克隆的梨PbSWEET4基因在不同梨品种叶片发育过程中的表达模式分析。(A)：‘丰水’(PyruspyrifoliaN.cv.Hosui)；(B)：‘库尔勒香梨’(PyrussinkiangensisYu)；(C)：‘鸭梨’(PyrusbretschneideriRehd.cv.Yali)；(D):‘南果’(PyrusussuriensisMaxim)。以‘丰水’、‘库尔勒香梨’、‘鸭梨’和‘南果’梨为试材，分析PbSWEET4基因在不同发育程度(图中的1-4代表由幼嫩到成熟的程度)的叶片中的表达模式。图2为本专利技术克隆的梨PbSWEET4基因2kb启动子控制下的转基因拟南芥在不同发育时期GUS染色定性分析结果。(A)：播种后14天；(B)：播种后18天；(C)：播种后30天；(D)：播种后42天。图3为本专利技术克隆的梨PbSWEET4基因在烟草表皮细胞的亚细胞定位结果图。(A)：35S::YFP(对照)在荧光下的成像；(B)：35S::YFP(对照)在明场下的成像；(C)：(A)、(B)叠加后的成像；(D)：35S::YFP-PbSWEET4在荧光下的成像；(E)：35S::YFP-PbSWEET4在明场下的成像；(F)：(D)、(E)叠加后的成像。图4为过表达PbSWEET4基因对草莓叶片生长的影响。(A)：PbSWEET4转基因植株的鉴定。(B)：过表达PbSWEET4基因植株与野生型对照；(C)：过表达PbSWEET4基因植株与野生型叶片对照。图5为过表达PbSWEET4基因对草莓叶片可溶性糖和叶绿素含量的影响。(A)：PbSWEET4基因在草莓植株中过量表达对叶片可溶性糖的影响；(B)：PbSWEET4基因在草莓植株中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离自梨的具有糖外排功能的基因PbSWEET4，其特征在于核酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，cDNA全长序列为918bp，包含918bp的开放阅读框。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离自梨的具有糖外排功能的基因PbSWEET4，其特征在于核酸序列如序列表SEQIDNo.1所示，cDNA全长序列为918bp，包含918bp的开放阅读框。


2.权利要求1所述的PbSWEET4编码的蛋白，其特征在于氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示，编码305个氨基酸，等电点为7.17，分子量为34.2KDa。


3.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。


4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pMDC32为出发的载体，将权利要求1所述基因PbSWEET4通过Gateway反应插入pMDC32所得。


5.含有权利要求1所述的基因的宿主菌。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊，泥江萍，李甲明，张绍铃，朱荣香，刘海楠，薛程，张明月，刘月园，李晓龙，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32