番茄SlBZR1L基因的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及番茄SlBZR1L基因在调控果实硬度中的应用，SlBZR1L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，SlBZR1L基因在提高果实硬度中起到负向调控作用。

【技术实现步骤摘要】
番茄SlBZR1L基因的应用
本专利技术属于生物
；具体涉及番茄SlBZR1L基因在调控果实硬度中的应用。
技术介绍
番茄原产于南美洲，是全世界栽培最广泛的蔬菜作物之一，我国的番茄种植面积和产量都位居世界前列。随着番茄产量的提高，番茄采后货架期损失成为制约番茄产业发展的重要问题。如何提高番茄果实品质从而延长番茄贮藏时间，正日益受到番茄销售者和科研工作者的关注。番茄果实硬度是影响番茄果实货架期的首要因素，提高果实硬度能显著延长番茄果实货架期；延长果实货架期减少采后损失，有效避免番茄销售者因这些损失造成的经济利益流失。SlBZR1L(Solyc04g079980)是油菜素甾醇(Brassinosteroids，BR)信号转导途径的核心转录因子BES1的番茄同源基因之一。目前研究只关注BES1在拟南芥中抵抗逆境的功能。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供SlBZR1L基因在提高果实硬度中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供SlBZR1L基因的用途：调控果实硬度，SlBZR1L基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述。作为本专利技术SlBZR1L基因的用途的改进：所述果实为番茄。SlBZR1L基因用于构建转基因番茄，所述转基因番茄的硬度显著得到调控。SlBZR1L基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。过往研究只关注BES1在拟南芥中抵抗逆境的功能。而其同源基因SlBZR1L在番茄果实中负调控番茄果实硬度的功能未见报道。本专利技术首次构建了番茄SlBZR1L基因过表达和基因沉默植株，并进行功能研究。通过测定果实硬度，发现SlBZR1L基因在提高果实硬度中起到负向调控作用。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是SlBZR1L基因过表达载体pGWB17-SlBZR1L载体图谱。图2是SlBZR1L基因沉默载体pBIN19：：SlBZR1L载体图谱。图3是SlBZR1L基因过表达和基因沉默果实中SlBZR1L基因的表达量；叶片(Leaves，L)，绿熟期(Maturegreen，MG)，破色期(Breaker，B)，粉色期(Pink,P)，红熟期(Redripe，R)。星号代表株系与对照具有显著差异(p<0.05)。图4是SlBZR1L基因过表达果实和基因沉默果实的果实硬度；绿熟期(Maturegreen，MG)，破色期(Breaker，B)，粉色期(Pink,P)，红熟期(Redripe，R)。不同字母代表不同组之间具有显著差异(p<0.05)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：一、获得番茄SlBZR1L基因全长序列：用PrimerPremier6.0设计全基因扩增引物，取种植在浙江大学紫金港校区温室的野生型番茄AilsaCraig(AC)叶片cDNA为模版(cDNA的提取方式为常规技术，例如可参照CN104561025A)，设计特异性引物SlBZR1L-F和SlBZR1L-R，用PrimerSTAR高保真酶PCR扩增SlBZR1L片段。引物序列为：SlBZR1L-F：5’-ATGTGGGAAGGTGGAGGGTTGC-3’SlBZR1L-R：5’-CATCCGAGCAGTCCCACTTCCGA-3’PCR扩增反应体系：2xPrimerSTARbuffer25ul、dNTPMixture5ul、PrimerSTARDNApolymerase1ul、ddH2O16ul、cDNA1ul、上下游引物各1ul，共50ul。PCR反应程序为：94℃预变性90秒；94℃变性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；最后72℃终延伸5分钟，将获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将扩增条带用AxygenDNA凝胶试剂盒回收纯化，将回收产物构建到pQB-V3载体上，将上述重组质粒送到擎科公司测序确认。所得基因SlBZR1L的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。二、SlBZR1L基因过表达载体的构建SlBZR1L过表达载体的构建，以pGWB17为终载体，构建具有CaMV35S重组型过表达启动子的pGWB17-SlBZR1L载体。利用LR反应将目的片段(即，SEQIDNo：1所述序列)从pQB-V3初始载体中转移到带有pGWB17终载体上。使用LRIIEnzymemix(ThermoFisher)试剂盒，方法参照试剂盒中说明书。反应后将pGWB17-SlBZR1L质粒转入大肠杆菌Top10感受态中。涂布法筛选，并用菌落PCR筛选出带有目的片段的pGWB17重组质粒(满足大小为1000bp左右条带的即为pGWB17重组质粒)，测序鉴定。用DNAMAN软件分析测序结果。正确转化子命名pGWB17::SlBZR1L(图1)。三、SlBZR1L基因沉默载体的构建RNAi干扰载体以pHANNIBAL为原始载体，通过PCR和酶切重组，构建CaMV35S启动子驱动下的SlBZR1L发卡沉默单元。选取SlBZR1L基因全长片段中约305bp的片段，确定该片段的序列没有编码的其它基因，以这样的序列作为RNA干扰的片段。最终利用原始载体pHANNIBAL和中间载体pBIN19共同的酶切位点SacⅠ&SpeⅠ酶切位点最终整合到植物双元载体pBIN19上，最终得到基因沉默载体pBIN19：：SlBZR1L(图2)。基因沉默用到的305bp的片段为：AGTCCCTAAGCAGATATTTAATCTTGAGACTTTGGCTAGAGAGTCTATGTCTGCTCTAAATATCCCTTTCTTTGCTGCTTCAGCCCCAACTAGCCCAACTCGAGGTCAGCGATTCACTCCTGCTACAATACCAGAGTGTGACGAATCTGATTCATCCACCATTGATTCTGGCCAGTGGATGAGCTTTCAAAAGTACGCAGCCAATGGGATCCCTACTTCTCCGACTTTTAATCTTATTAAGCCTGTAGCTCAGAGAATTCCTTCTAATGATATGATCATCGACAAGGGTAAGAGCATTGAATTTG。四、转基因材料的构建与检测：将过表达载体pGWB17::SlBZR1L或基因沉默载体pBIN19：：SlBZR1L结合转移至农杆菌LBA4404，并进行番茄子叶侵染，通过诱导愈伤，抗性诱导分化以及生根培养，获得组培苗，利用PCR和RT-PCR验证阳性转基因植株。将T2代种子播在卡那霉素(50mg/L)的培养基上发芽，得到5个过表达转基因株系。备注说明：满足种子在卡那霉素(50mg/L)的培养基上长侧根与未长侧根的分离比符本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SlBZR1L基因的用途，其特征是：调控果实硬度，SlBZR1L基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所述。/n

【技术特征摘要】
1.SlBZR1L基因的用途，其特征是：调控果实硬度，SlBZR1L基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俏梅，刘浩然，刘丽红，邵志勇，孟凡亮，梁冬怡，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33