一种内皮化生物心脏瓣膜及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种内皮化生物材料及其制备方法，制备方法为：先扩增含有VEGF的质粒；然后提取VEGF质粒的DNA；再将提取的质粒DNA转染内皮细胞；然后将转染后的细胞与凝胶基质混合，并用混合物包覆生物材料；随后加入内皮细胞悬液，于37℃下培养20～26h，再用多聚甲醛固定，得内皮化生物心脏瓣膜。本发明专利技术提供的方法通过将包裹VEGF质粒DNA的水凝胶制作成心脏瓣膜材料，能够提升生物材料的内皮化，进而减少钙化，心脏瓣膜的使用寿命延长。

An endothelial biological heart valve and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种内皮化生物心脏瓣膜及其制备方法
本专利技术属于生物医学材料
，具体涉及一种内皮化生物材料及其制备方法。
技术介绍
目前临床上使用的生物瓣膜通常是采用戊二醛交联的猪或牛的心包膜制备而成。但是戊二醛交联的生物瓣膜仍然存在钙化的问题。生物瓣膜的钙化引发的重要原因之一是无法内皮化。在人体正常工作的心脏瓣膜上，内皮细胞能够预防凝血、减少钙化。由于戊二醛具有很大的细胞毒性，戊二醛交联的生物瓣膜不利于内皮细胞的生长和增殖，导致其无法内皮化。小干扰RNA被用作特定序列的基因沉默因子，其主要作用于引起疾病蛋白质的信使RNA。此外，质粒DNAs(pDNA)也是冠状动脉基因治疗的有吸引力的选择。近年来，有一系列的研究表明，使用裸质粒DNA包裹或分散在生物可降解合成聚合物或天然高分子涂层支架上进行基因递送，例如包括聚乳酸(PLGA)和编码治疗基因的脂质(聚)复合涂层，治疗基因包括编码人类血管内皮生长因子的基因，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，诱导型一氧化氮合酶，血小板衍生生长因子(PGDF)和前列环素基因等等。内皮细胞生长因子(VEGF)能够促进内皮细胞的粘附和增殖，有利于新生毛细血管的形成。有报道表明，采用VEGF装载的表面改性涂层能够促进生物瓣膜的内皮化。然而，基于静电作用装载的VEGF含量以及稳定性有限。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种提升生物材料的内皮化，进而减少钙化，潜在地延长其使用寿命的生物心脏瓣膜促进内皮化的方法。为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：提供一种内皮化生物材料，该生物材料通过以下步骤制得：(1)获取HumanVEGFAtranscriptvariant4ORFmammalianexpressionplasmid，C-GFPSparktag质粒DNA及扩增：将含有内皮细胞生长因子(VEGF)的质粒冻干粉重悬，并在冰上融化感受态细胞；将质粒2μL加入到融化的感受态细胞100UL中，然后依次将质粒-感受态细胞复合物进行冰浴30min、42℃热激45s和冰浴2min处理，随后将复合物加入到不含抗生素的液体培养基中放入37℃摇床上，以200rmp的转速培养60min；然后取出，以5000rmp的速率离心5min丢弃上清，加入含抗生素的液体培养基60μL，重悬之后滴在含抗生素平板上涂布过夜培养。在20mL试管中，将携带有所需质粒的大肠杆菌接种到5mL培养基中，37℃振荡培养12～16h。(2)提取质粒DNA：利用Omega公司的E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKitI小提试剂盒，对经过步骤S1扩增后得到的含有质粒DNA的菌液进行提取。具体的为：取2mL菌液室温下6000×g离心2min，去上清，加250μL溶液I(含RNaseA)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。加250μL溶液II，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。加350μL溶液III，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温13000×g离心10min。吸取离心后上清，移至洁净的装配好容积为2mL离心管的吸收柱中，室温13000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。弃滤过液，加500μLBufferHB，13000×g离心1min，弃滤过液。再用100％乙醇稀释的750μLWashBuffer清洗吸收柱，13000×g离心1min。将吸收柱放入干净1.5mL离心管，加60μL无菌去离子水在滤膜上，13000×g离心5min。收集提取及纯化的质粒。(3)将步骤S2提取后得到的质粒DNA进行测序，确定为所需质粒DNA。(4)将步骤S2提取后得到的质粒DNA通过LipofectamineTM3000转染内皮细胞(Huevc)。(5)将通过步骤S4转染后得到的细胞，利用倒置荧光显微镜进行拍照，流式细胞仪测定转染和未转染内皮细胞荧光含量不同，以确定转染效率。通过荧光定量PCR和蛋白质印迹法测定转染后内皮细胞内VEGF的mRNA及表达蛋白含量，证明转染后的内皮细胞VEGF高表达。通过划痕实验，证明转染VEGF后的内皮细胞迁移能力增强。通过CCK-8细胞增殖实验证明，转染后内皮细胞增殖能力增强。(6)将通过步骤S4转染后得到的细胞结合生物材料：将生物材料平放在48孔板，75％乙醇灭菌1h，去离子水清洗2次。然后配制20mL质量浓度为5％透明质酸溶液(HA)，透明质酸分子量为100W，加入0.1MNaOH溶液搅拌过夜。取三份灭菌后的生物材料，分别放入48孔板的三个孔洞中，并划定三个空白孔为对照孔，含有生物材料孔和空白孔均加入100μL5％的HA，然后含有生物材料的每一孔均加入10μL转染内皮细胞的VEGF质粒DNA和20μL20％的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，37℃震荡2h，再放置于4℃冰箱冷藏保存。用3mL胰酶消化10cm直径培养内皮细胞的培养皿，细胞悬液以1200rpm的速率离心3min，移除上清液；分别向生物材料孔和空白孔的每孔加入0.4mL细胞悬浮液，培养24h。吸出样品培养基。使用0.5mL每孔PBS洗涤2次，每次5～10min；然后每个孔加入200微升4％的多聚甲醛固定10min，得内皮化生物心脏瓣膜。使用0.5mL每孔PBS洗涤2次，每次5～10min。加入0.5％triton-x100的PBS溶液透化5min。加入200μL100nm鬼笔环肽染料，染色20min。使用0.5mL每孔PBS洗涤3次，每次15min。加入200μL1/1000mg/ml的DAPI染料，染色5min。使用0.5mL每孔PBS洗涤2次，每次5min。样品放在载玻片上荧光观察。在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。进一步，生物材料为心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、皮肤或韧带。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的方法通过将包裹VEGF质粒DNA的水凝胶制作成心脏瓣膜材料，能够提升生物材料的内皮化，进而减少钙化，心脏瓣膜的使用寿命延长。附图说明图1为质粒DNA转染内皮细胞后倒置荧光显微镜拍照图片；图2和图3为相同数量内皮细胞转染和未转染VEGF质粒细胞增殖情况。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。实施例一：一种内皮化生物材料，其通过以下步骤制得：(1)获取HumanVEGFAtranscriptvariant4ORFmammalianexpressionplasmid，C-GFPSparktag质粒DNA及扩增：将含有内皮细胞生长因子(VEGF)的质粒冻干粉重悬，并在冰上融化感受态细胞；将质粒2μL加入到融化的感受态细胞100UL中，然后依次将质粒-感受态细胞复合物进行冰浴30min、42℃热激45s和冰浴2min处理，随后将复合物加入到不含抗生素的液体培养基中放入37℃摇床上，以200rmp的转速培养60min；然后取出，以5000rmp的速率离心5min丢弃上清，加入含抗生素的液体培养基60μL，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内皮化生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：扩增含有VEGF的质粒；/nS2：提取VEGF质粒的DNA；/nS3：将S2提取的质粒DNA转染内皮细胞；/nS4：将转染后的细胞与凝胶基质混合，并用混合物包覆生物材料；然后加入内皮细胞悬液，于37℃下培养20～26h，再用多聚甲醛固定，得内皮化生物心脏瓣膜。/n

【技术特征摘要】
1.一种内皮化生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：扩增含有VEGF的质粒；
S2：提取VEGF质粒的DNA；
S3：将S2提取的质粒DNA转染内皮细胞；
S4：将转染后的细胞与凝胶基质混合，并用混合物包覆生物材料；然后加入内皮细胞悬液，于37℃下培养20～26h，再用多聚甲醛固定，得内皮化生物心脏瓣膜。


2.根据权利要求1所述的内皮化生物心脏瓣膜的制备方法，其特征在于，S1中扩增含有VEGF的质粒包括以下步骤：将含有VEGF的质粒冻干粉重悬，并在冰上融化感受态细胞；然后将质粒与感受态细胞按1:45～55的体积比混合，再依次对混合物进行冰浴30min、42℃热激45s和冰浴2min处理，随后将混合物加入到不含抗生素的液体培养基中，于37℃下摇床培养60min，然后离心、丢弃上清并加入含抗生素的液体培养基，重悬之后滴在含抗生素的平板上涂布过夜培养。

【专利技术属性】
技术研发人员：雷洋，王云兵，邓璐，王刚，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51