一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。采用本发明专利技术的检测方法可以消除硫代甘油对细菌内毒素的干扰作用，稀释的倍数小，检测结果准确可靠、操作简便，检测成本低，相对于光度法检测，操作方便、简单。

【技术实现步骤摘要】
一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法
本专利技术属于药物分析领域，具体涉及一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法。
技术介绍
细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏细胞灭活，不造成机体损害，内毒素大量进入血液就会引起发热反应——“热原反应”，甚至导致死亡。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。制剂中的细菌内毒素，最大来源为生产用原辅料，因此，生产制剂的原辅料的内毒素水平同样需要监控。硫代甘油是一种无色或微白色，粘稠，具吸湿性的液体，是药物制剂中经常用到的辅料，作为抗氧剂和防腐剂，结构式如下。因此用于制剂生产的硫代甘油，也需要进行细菌内毒素检测。目前，细菌内毒素检测主要有两种方法，分别为：凝胶法和光度法。凝胶法操作简单，普及程度高，试验条件要求低(37±1℃，60±2分钟)。而光度法，操作相对复杂，普及程度低，试验需要酶标仪等专业的设备。凝胶法因上述优势，被各国药典选择作为仲裁试验的方法(当内毒素检测结果出现争议时，以凝胶法结果为准)。硫代甘油因为结构式中巯基(-SH)的存在，能破坏鲎试剂中的凝固酶原、凝固蛋白原，引发细菌内毒素反应的抑制作用，即便样品中含有细菌内毒素，也会因为样品对细菌内毒素检测的抑制作用，而使检测结果呈现“假阴性”。目前市面上采用的消除上述抑制作用的方法主要为：对硫代甘油进行较大倍数的稀释(如稀释1200倍)后，采用光度法进行细菌内毒素检测。然而，光度法检测时，操作复杂，试验需要酶标仪等专业的设备，普及程度低。
技术实现思路
本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法。本专利技术的技术方案如下：一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。本专利技术以细菌内毒素检查用水溶解或稀释硫代甘油制备体积浓度为1％硫代甘油。进一步地，过氧化氢溶液也采用细菌内毒素检查用水进行配置，例如，在制备供试品溶液时，将体积浓度为35％过氧化氢以细菌内毒素检查用水稀释至体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢。在制备供试品溶液时，对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液采用细菌内毒素检查用水进行稀释，在不超过最大有效稀释倍数的情况下，按照《2015药典细菌内毒素检查法》，进行细菌内毒素及检查。在一种优选方案中，在不超过最大有效稀释倍数的情况下，先以各稀释倍数的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最小稀释倍数，再以该最小稀释倍数稀释制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。在本专利技术中，根据待测硫代甘油油细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最大有效稀释倍数，例如：硫代甘油细菌内毒素限值为6EU/mL；鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；可以确定其最大有效稀释倍数为400倍。在本申请中，制备供试品溶液时，过氧化氢(双氧水)的用量很重要，加入过氧化氢时硫代甘油的浓度也需要严格控制，加入过氧化氢时硫代甘油的体积浓度约1％，硫代甘油的浓度过高或者过低都不易排除干扰作用，影响检测细菌内毒素的准确性。过氧化氢的用量过高或者过低也影响本申请检测硫代甘油中细菌内毒素的含量的准确性，在不破坏细菌内毒素的前提下，消除硫代甘油对细菌内毒素检测的干扰作用。当过氧化氢的用量较低时，不能够消除样品中硫代甘油的干扰作用，而使检测结果呈现“假阴性”；当过氧化氢的用量较高时，破坏了样品中的细菌内毒素，也会使检测结果呈现“假阴性”。在一种优选方案中，在制备供试品溶液时，将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.225％过氧化氢等比例混合，以细菌内毒素检查用水在不超过最大有效稀释倍数的情况下进行稀释。在一种更优选方案中，在制备供试品溶液时，将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.35％～1.05％过氧化氢等比例混合，以细菌内毒素检查用水在不超过最大有效稀释倍数的情况下进行稀释。本专利技术检查硫代甘油中细菌内毒素时，待测硫代甘油细菌内毒素限值为6EU/mL；选择的鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL，以各稀释倍数的供试品溶液进行干扰实验时，找出无干扰情况下的最小稀释倍数为400倍，再以稀释至400倍时制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。本专利技术可以采用凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的含量，只需要对硫代甘油进行400倍稀释，并加入适量的过氧化氢，从而消除硫代甘油对细菌内毒素的干扰作用，相对于光度法检测，操作方便、简单。在一种方案中，供试品溶液的制备方法如下：用1.8ml细菌内毒素检查用水溶解0.2ml硫代甘油后，再稀释至100倍得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和8～40μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。在一种优选方案中，供试品溶液的制备方法如下：用1.8ml细菌内毒素检查用水溶解0.2ml硫代甘油后，再稀释至100倍得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和10～30μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。在一种更优选方案中，供试品溶液的制备方法如下：用1.8ml细菌内毒素检查用水溶解0.2ml硫代甘油后，再稀释至100倍得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和10μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。采用本专利技术的技术方案，优势如下:本专利技术采用凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素，只需将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。采用本专利技术的检测方法可以消除硫代甘油对细菌内毒素的干扰作用，稀释的倍数小，检测结果准确可靠、操作简便，检测成本低，相对于光度法检测，操作方便、简单。具体实施方式通过以下实施例对本专利技术的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本专利技术构成任何限制。试验准备：1、试剂硫代甘油；鲎试剂(λ＝0.015EU/mL，查尔斯河试验室)；细菌内毒素标准品；细菌内毒素检查用水；过氧化氢(双氧水)。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。/n

【技术特征摘要】
1.一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体积浓度为1％硫代甘油中的溶剂为细菌内毒素检查用水；所述体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢中的溶剂为细菌内毒素检查用水；制备所述供试品溶液时采用细菌内毒素检查用水进行稀释。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先以各稀释倍数的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最小稀释倍数，再以该最小稀释倍数稀释制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，先以硫代甘油细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最大有效稀释倍数，其中：所述硫代甘油细菌内毒素限值为6EU/mL；所述鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；所述最大有效稀释倍数为400倍。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过氧化氢的体积浓度为0.28％～1.225％。


6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐咏群，冷玲，柯乐，
申请(专利权)人：南京健友生化制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32