一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。终止液为2 M浓硫酸。CP重组抗原的序列为SEQ ID NO.1。通过方阵优化最佳抗原包被浓度和血清稀释度、确定酶标二抗稀释度、确定封闭液种类和封闭时间、抗体孵育时间。本发明专利技术用于检测CP抗体具有特异性强、敏感性高、稳定性好和通量高等优点，可以很好的而检测人体血清中CP抗体，对临床诊断具有一定的指导意义。

An indirect ELISA kit for the detection of Chlamydia pneumoniae antibody and its detection method

【技术实现步骤摘要】
一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，特别是一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
肺炎衣原体(Chlamydiapneumonia,CP)是一种全球比较常见的社区获得性肺炎的主要病原之一，幼儿和老年人是易感人群，四季均可发病，主要经由飞沫传染。临床上主要以呼吸道症状，咽痛、声嘶、流涕等，也可表现发烧、咳嗽。CP感染通常是轻度的、自限性的疾病，由于其症状不典型，故常常被忽略或是漏诊。研究表明，CP感染与一些慢性疾病有关，例如，哮喘、中耳炎、结节性红斑、动脉粥样硬化及心内膜炎、冠心病等，CP感染还会导致脑血管和中枢神经系统受损，严重者会危及生命，引起广泛关注。现阶段CP的检测方法主要有：细胞的分离培养、血清学检测、分子生物学方法和联合检测。上述检测方法存在的问题有：第一，CP是一种专性胞内寄生菌，分离培养周期长、成本高；第二，PCR检测衣原体DNA，其特异性和敏感性高，但是对实验室环境有特殊要求，实验室需要配备高端设备和高级技术人员，而且PCR的假阳性率难以控制，一般实验室难以开展；第三，血清学的检测方法由于其通量高、成本低、特异性强和灵敏度高等优点，广泛的应用于临床检测和流行病学调查。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，解决现阶段检测成本高、灵敏度有限、特异性差、对检测环境要求高、培养时间长、PCR的假阳性率难以控制等技术问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术一方面提供一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。进一步，终止液为2M浓硫酸。进一步，CP重组抗原的序列为SEQIDNO.1。进一步，抗原包被方法是：使用CBS碳酸盐缓冲溶液稀释蛋白质浓度至2μg/mL，100μL/孔，放于4℃包被12-18h。进一步，稀释液和洗涤液都是含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(10×)，使用去离子水稀释成1×即可直接使用。进一步，阴性对照血清是临床上诊断未感染肺炎衣原体的人血清。进一步，阳性对照血清是临床上确诊有肺炎衣原体的人血清。本专利技术另一方面还提供使用上述检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法，步骤一，一抗孵育：取出试剂，待恢复室温后，将阴阳性对照液和待检样品使用血清稀释板稀释所需的稀释倍数，转至抗原板，孵育；步骤二，二抗孵育：使用PBST洗液洗涤后加入酶标二抗，孵育；步骤三，显色：洗涤后加入显色液反应；步骤四，终止：加入终止液，测定其吸光光度值。本专利技术的有益效果体现在：1，本专利技术提供的一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，通过方阵优化最佳抗原包被浓度和血清稀释度、确定酶标二抗稀释度、确定封闭液种类和封闭时间、抗体孵育时间。本专利技术用于检测CP抗体具有特异性强、敏感性高、稳定性好和通量高等优点，可以很好的检测人体血清中CP抗体，对临床诊断具有一定的指导意义。本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的主要目的和其它优点可通过在说明书中所特别指出的方案来实现和获得。附图说明下面结合附图对本专利技术做进一步详细的说明。图1是HRP标抗的羊抗人二抗最适稀释度的确定。图2是HRP标抗的羊抗人二抗最适孵育时间的确定。图3是TMB显色时间的确定。具体实施方式以下通过实施例来详细说明本专利技术的技术方案，以下的实施例仅仅是示例性的，仅能用来解释和说明本专利技术的技术方案，而不能解释为对本专利技术技术方案的限制。本专利技术使用本实验室研制的CP抗原作为抗原，经过优化ELISA检测方法，最终确定该抗原可以很好的应用于CP抗体检测。实验中，以阳性OD450值/阴性OD450值(P/N)最大时作为最佳反应条件。本实验所用到的酶标板购自CORNING公司，羊抗人IgG和TMB显色液使用的是索莱宝品牌。本专利技术一方面提供一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。其中，终止液为2M浓硫酸。稀释液和洗涤液都是含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(10×)，使用时使用去离子水稀释成1×即可直接使用。其中，CP重组抗原的序列为SEQIDNO.1。选取反应原性强的蛋白质进行序列分析和密码子优化，最终送至金唯智生物技术有限公司进行基因合成，成功构建重组质粒、转入BL21表达菌诱导表达、纯化、复性和透析，成功制备了CP重组抗原。抗原包被方法是：使用CBS碳酸盐缓冲溶液稀释蛋白质浓度至2μg/mL，100μL/孔，放于4℃包被12-18h。封闭：取出包被ELISA板，弃去包被液，使用PBST(0.05％吐温-20，pH7.4)洗涤5次，3min/次，弃尽洗液后加入2％BSA(pH7.4的PBS稀释)，200μL/孔，37℃封闭2h。阴性对照血清是临床上诊断未感染肺炎衣原体的人血清。阳性对照血清是临床上确诊有肺炎衣原体的人血清。使用检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒的检测方法，步骤一，一抗孵育：取出试剂，待恢复室温后，将阴阳性对照液和待检样品使用血清稀释板稀释所需的稀释倍数，转至抗原板，孵育；步骤二，二抗孵育：使用PBST洗液洗涤后加入酶标二抗，孵育；步骤三，显色：洗涤后加入显色液反应；步骤四，终止：加入终止液，测定其吸光光度值。具体的，一抗孵育：取出ELISA板，弃去封闭，使用PBST洗涤5次，3min/次，加入1：50稀释血清，100μL/孔，37℃孵育1h。二抗孵育：取出ELISA板，弃去一抗孵育液，使用PBST洗涤5次，3min/次，加入1：10000稀释的HRP标记羊抗人IgG二抗，37℃孵育45min。显色：取出ELISA板，弃去二抗孵育液，使用PBST洗涤5次，3min/次，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色10min。终止：取出酶标板，加入2M的浓硫酸，50μL/孔.读数：使用酶标仪读取其OD450值，并保存。间接ELISA的条件优化最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定采用方阵滴定法，用包被液将rCP进行2倍比稀释，终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/mL，每孔加入100μL，每个稀释度重复两排，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液(pH7.4的PBST溶液)洗涤5次，每次3min；每孔加入200μL封闭液(5％脱脂奶粉)于37℃封闭2h；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括肺炎衣原体重组抗原ELISA包被酶标条、血清稀释板、稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标二抗结合物、洗涤液、TMB显色液和终止液。


2.如权利要求1所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，终止液为2M浓硫酸。


3.如权利要求1所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，CP重组抗原的序列为SEQIDNO.1。


4.如权利要求3所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，抗原包被方法是：使用CBS碳酸盐缓冲溶液稀释蛋白质浓度至2µg/mL，100µL/孔，放于4℃包被12-18h。


5.如权利要求4所述的检测肺炎衣原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，郭晓，
申请(专利权)人：南京拂晓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32