基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法技术

本发明专利技术涉及一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒、检测方法及其制备方法，通过制备2株针对HIV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠①)，另一株重组抗原用铕离子标记；同时制备另外2株针对HCV患者体液中抗体的特异性重组抗原，其中一株重组抗原用于偶联磁珠(免疫磁珠②)，另一株重组抗原用钐离子标记。先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①‑HIV抗体‑铕标记抗原复合物，及免疫磁珠②‑HCV抗体‑钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附人HIV及HCV抗体的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。本发明专利技术检测灵敏度高、时间短、误差小且可靠性高。

Time-resolved fluoroimmunoassay of double labeled anti HIV and HCV based on immunomagnetic beads

【技术实现步骤摘要】
基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法
本专利技术涉及一种磁性分离技术和时间分辨荧光免疫分析技术的结合，具体是一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法及相应的试剂盒。
技术介绍
艾滋病是一种由人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)感染人免疫系统细胞并造成免疫系统缺陷，严重威胁人类健康的疾病。针对该疾病目前尚无免疫预防、无根除体内病毒的有效药物，因此具有高感染率、高病死率的特征。丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染引起的病毒性肝炎。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。由于HIV与HCV都可以通过输血、静脉吸毒、性传播、母婴垂直传播等途径传播,因而HIV和HCV共感染比较常见。有研究表明，HIV和HCV合并感染率达30％，在吸毒人群中甚至高达70％以上。大部分HIV感染者的肝脏疾病是因为混合感染HCV的结果。丙型肝炎感染引起的慢性肝脏疾病会增加HIV感染者因肝脏损伤，其引起的死亡已成为艾滋病患者死亡的主要原因之一，且共感染可加速HCV感染相关疾病的过程。因此,对HIV、HCV两者合并感染这一世界性的重要公共卫生问题的研究十分重要。从1985年第1代HIV抗体检测试剂问世到现在，HIV血清学检测试剂已经发展到了第4代。第4代ELISA试剂的优点在于能同时检测抗原和抗体，降低血源筛查的残余危险度，在对艾滋病早期诊断的效果上明显优于第3代。但从方法学上来讲，这种基于ELISA的分析方法，灵敏度终归是有限的。相对时间分辨荧光免疫分析技术和化学发光等更先进的分析方法，它的灵敏度比较低。HCV血清学检测试剂在市场化中也存在同样的问题。由此可见，提高敏感性、特异性、缩短窗口期和简便快速是HIV及HCV检测试剂未来发展的主要趋势。时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰，并且可以对同一样品不同分析物进行标记和应用范围十分广泛等优点。然而，目前国内外厂家均采用基于微孔板TRFIA技术研制相应的试剂盒(包括PerKinElmer公司试剂盒)，由于微孔板的固液相反应面积小，需要的免疫反应时间较久；并且微孔板是通过物理吸附包被抗原或抗体，包被量很难标准化，使得检测结果精密度较差；微孔板TRFIA技术主要为半自动检测，或前处理加上TRFIA检测仪的准全自动检测，使得样本需要积累到一定量后才能检测。生物素-亲和素系统(biotin-avidinsystem，BAS)是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。自20世纪70年代，BAS开始应用于免疫化学领域以来，利用BAS可被荧光索、酶、放射性核素等材料标记的特点而发展和建立了许多新的检测方法和技术，尤其是与免疫标记技术的有机结合，极大地提高了测定的灵敏度。目前，BAS技术已在整个生物学领域中得到广泛应用，成为当今生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。免疫磁珠是免疫学和磁载体技术相结合而发展起来的一类新型材料，是一种磁珠表面包被特异性配基，可与抗原或抗体特异性结合形成磁珠-抗原/抗体复合物，然后通过外加磁场的作用，使磁珠和溶液快速分离，可以在短时间内得到浓缩，纯净的待测样品，缩短反应和检测时间，提高检测灵敏度及检测效率。目前免疫磁珠结合酶免检测方法是在免疫检测领域最主要的应用，其采用免疫磁珠配合常规ELISA方法主要用于免疫检测、细胞和微生物的分离和蛋白质、DNA、RNA以及mRNA等生物大分子纯化检测，但免疫磁珠结合双标记时间分辨应用于HIV和HCV传染病监测尚无文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，具有测试灵敏度高，稳定性好的特点。本专利技术的上述目的通过如下技术手段实现。提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。优选的，上述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，还含有两株生物素化的HIV抗原和两株生物素化的HCV抗原；其中一株HIV抗原用于偶联免疫磁珠①，另外一株HIV抗原用铕离子标记；一株HCV抗原用于偶联免疫磁珠②，另外一株HCV抗原用钐离子标记。优选的，上述的述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，检测方法是先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①-HIV-Ab-铕标记抗原复合物、免疫磁珠②-HCV-Ab-钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。本专利技术的目的之二在于提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，利用磁分离技术并整合时间分辨免疫荧光分析法，除了拥有TRFIA技术的灵敏度高、稳定性好诸多特点外，磁珠结合应用于时间分辨与传统的微孔板时间分辨荧光免疫分析方法相比还具有以下的特点：①表面积更大，能结合更多的蛋白分子；②可以通过共价键与探针分子连接，比聚苯乙烯为材料的微孔板的物理吸附作用更牢固；③是一种小型的、流动的固相载体，使反应能更快地达到动态平衡，从而加快反应速度；④表面结合的密度高，使荧光信号更集中；⑤可以和不同的探针分子结合，使检测同一样本中不同的待测物成为可能；⑥磁珠的外观和包被过程的灵活性更大，可以根据不同的实验要求进行选择。本专利技术的上述目的通过如下技术手段实现。提供一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，具有如下步骤，(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。/n

【技术特征摘要】
20191114 CN 20191111188091.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：含有偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠、偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠、铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag，偶联有HIV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠①，偶联有HCV重组抗原的免疫磁珠称为免疫磁珠②。


2.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：还含有两株生物素化的HIV抗原和两株生物素化的HCV抗原；
其中一株HIV抗原用于偶联免疫磁珠①，另外一株HIV抗原用铕离子标记；
一株HCV抗原用于偶联免疫磁珠②，另外一株HCV抗原用钐离子标记。


3.根据权利要求2所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：检测方法是先通过双抗原夹心的免疫反应，形成免疫磁珠①-HIV-Ab-铕标记抗原复合物、免疫磁珠②-HCV-Ab-钐标记抗原复合物，再通过磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤，最后加入增强液并通过时间分辨仪器测值。


4.一种基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：具有如下步骤，
(1)链霉亲和素磁珠制备：具体经过磁珠活化、链霉亲和素与磁珠偶联、洗涤、封闭、保存步骤制备得到链霉亲和素磁珠；
(2)生物素化抗原制备：具体经过生物素与抗原连接、透析、保存步骤制备得到高特异性的生物素化的HIV和HCV抗原；
(3)铕和钐离子标记抗原制备：具体是分别选用一株HIV-Ag进行Eu3+标记，一株HCV-Ag进行Sm3+标记，制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag；其中，以体积比计，HIV-Ag与Eu3+标记物的比例为5:1，HCV-Ag与Sm3+标记物的比例为2.5:1；
(4)测定方法：
往反应管加入100μl样品，再加入用分析缓冲液以体积比为1:30稀释的步骤(1)制备的链霉亲和素磁珠50μl，然后加入用分析缓冲液以体积比为1:100稀释的步骤(2)制备的生物素化抗原各50μl，室温震荡孵育45分钟；运用磁性分离技术将吸附HIV-Ab及HCV-Ab的免疫磁珠与上清分离洗涤；最后加入用分析缓冲液以体积比为1:25稀释的步骤(3)制备得铕离子标记HIV-Ag及钐离子标记HCV-Ag各100μl，室温震荡孵育45分钟；重复分离洗涤步骤，最后加入200μl增强液震荡孵育5min进行荧光检测。


5.根据权利要求4所述的基于免疫磁珠的双标记抗HIV及HCV时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于：在步骤(1)中，
磁珠活化过程为：取1ml重悬后的磁珠,重复洗涤3次，加入25μl10mg/ml的EDC和40μl10mg/ml的NHS，用样本旋转混合仪，室温旋转30min；
洗涤过程中使用的洗涤液的为：将25mM的Tris-HCl、0.15MNaCl加入1ml体积百分比为0.05％的Tween20，用浓盐酸调节PH值得到pH7.2的缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴英松，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44