胎儿滋养层细胞的标志物、鉴定方法、检测试剂盒和应用技术

本发明专利技术属于生物细胞鉴定技术领域，具体涉及一种胎儿滋养层细胞的标志物、鉴定方法、检测试剂盒和应用。所述鉴定方法是采用用荧光标记的HK2抗体物质对含有胎儿滋养层细胞的样本进行染色处理，然后进行荧光检测，若HK2阳性的细胞就是目标细胞。所述试剂盒包括荧光标记的HK2抗体物质和细胞核染色剂。本发明专利技术提供的技术方案能够在孕早期妇女的宫颈粘液样本或血液样本中，较为灵敏可靠地检测到胎儿滋养层细胞，尤其可用于孕早期产前诊断。

Markers, identification methods, detection kits and application of fetal trophoblast

【技术实现步骤摘要】
胎儿滋养层细胞的标志物、鉴定方法、检测试剂盒和应用
本专利技术属于生物细胞鉴定
，具体涉及一种胎儿滋养层细胞的标志物、鉴定方法、检测试剂盒和应用。
技术介绍
目前，染色体异常的遗传性疾病尚无较好的治疗方法。因此，在孕早期通过产前诊断及时发现胎儿遗传信息的异常并积极干预，能够有效的降低出生缺陷率。目前临床中采用的产前诊断方法主要为有创性检查，如绒毛活检、羊水穿刺检查、胎儿脐血检测等，但这类有创性检查有一定的感染、流产风险。另外，对于试管婴儿可以进行植入前的产前诊断，但仅适用于试管婴儿，且对技术要求非常高。目前临床中采用的无创检查包括B超检查和孕妇血清生化检查，但这些方法只是适用范围有限的产前遗传疾病的辅助筛查手段而非产前诊断方法。因此，在孕早期实现无创产前诊断越来越引起人们的重视。目前已报道的方法主要包括从孕妇外周血中分离胎儿细胞及胎儿游离基因片段进行检测。孕妇外周血中的胎儿细胞包括胎儿有核红细胞、胎儿滋养层细胞等，但是由于孕妇外周血中胎儿细胞数目极少且不稳定，常难以分离到较多数目的胎儿细胞实现可靠检测。而孕妇外周血中的游离基因片段目前已被批准用于部分染色体三倍体的检测(如13、18、21等染色体)，但由于只是基因组的片段信息，无法获得胎儿完整的基因组信息，因此其能够检测的遗传疾病种类非常有限，而且这一方法为筛查方法而非诊断方法。早在1971年，Shettles等人就发现了孕早期妇女宫颈粘液内存在胎儿滋养层细胞，开启了宫颈内胎儿滋养层细胞用于产前诊断的研究。脱落的滋养层细胞来源于本次妊娠，不受上次妊娠的影响，获得的滋养层细胞含有胎儿的完整基因组信息，可用来检测本次妊娠胎儿的染色体情况。更重要的是，宫颈滋养层细胞的数目较多，且能出现于孕早期，为孕早期的产前诊断奠定了基础。进一步的研究显示滋养层细胞表达人白细胞抗原G(HLA-G)，可用于宫颈粘液中胎儿滋养层细胞的富集与分离。其他研究还报道了另外的用于鉴定胎儿滋养层细胞的标志物，如CK7,β-HCG等。但是，由于在宫颈处采集到的宫颈脱落细胞较为复杂，包括鳞状上皮细胞、宫颈柱状上皮细胞、宫颈腺上皮细胞、成纤维细胞、红细胞、白细胞、淋巴细胞、少量滋养层细胞等复杂的细胞组成，目前现有的标志物及检测方法难以在如此复杂的细胞样本中准确检测到的胎儿滋养层细胞。因此，需要发展更灵敏准确的标志物及相应的检测方法与试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供了一种胎儿滋养层细胞标志物、鉴定方法、检测试剂盒和应用，用以解决目前胎儿滋养层细胞鉴定灵敏性差，准确率低的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案提供了HK2在胎儿滋养层细胞鉴定或分离中的应用，所述HK2(己糖激酶2)作为胎儿滋养层细胞的生物标志物。可选地，所述胎儿滋养层细胞为宫颈粘液中的胎儿滋养层细胞。我们知道，在人妊娠早期，子宫内的缺氧环境有助于胎盘内的细胞增殖和血管生成，并引起滋养层细胞中糖酵解相关基因的表达。在胚胎发育过程中，绒毛外滋养层细胞脱落至宫颈管，被宫颈粘液包裹，这些滋养层细胞主要以糖酵解方式获取能量。另一方面，我们也知道，在糖酵解过程中，葡萄糖被细胞膜表面的葡萄糖转运体(GLUT)输运进入细胞后，首先在己糖激酶(HK)催化下进行磷酸化。现已发现的人类HK有4种亚型，分别由HK1、HK2、HK3和HK4基因编码生成。HK1广泛表达于几乎所有的哺乳动物组织中，HK2通常表达于胰岛素敏感组织如脂肪、骨骼和心肌中，但在多种肿瘤组织中高表达，通过与线粒体外膜上离子通道相互结合实现糖代谢的调控。HK3则往往低水平表达，HK4的表达则限制于胰腺和肝脏。本专利技术还提供了一种胎儿滋养层细胞的鉴定方法，其包括：用荧光标记的HK2抗体物质对含有胎儿滋养层细胞的样本进行染色处理，然后进行荧光检测，若HK2阳性的细胞就是目标细胞。荧光检测结果阳性判断是根据阈值确定，高于阈值为阳性，低于阈值为阴性，阈值可以采用本领域内常用方法和技术手段加以确认，比如在背景基本一致的情况下可以直接设定一个绝对值，背景影响较强时，采用平均值+五倍标准差来确定阈值。可选地，所述样本由孕期妇女宫颈粘液或外周血处理获得，处理过程为将宫颈粘液经液化或富集后的外周血制备成单细胞悬液，并将单细胞悬液以单细胞形式铺展于微孔阵列芯片或玻璃片，优选微孔阵列芯片。可选地，所述荧光标记的HK2抗体物质是HK2抗体，或者是HK2一抗与二抗的组合，其中所述HK2抗体被荧光素或其他荧光物质标记，所述HK2一抗与二抗的组合中HK2二抗被荧光素或其他荧光物质标记。可选地，所述鉴定方法还包括：用细胞核染色剂对所述样本进行染色处理，并进行荧光检测，其中HK2阳性且细胞核染色阳性的细胞为目标细胞。通过细胞核染色以排除非细胞物质对所述荧光检测结果的干扰。细胞核染色后，可直接观察区别，无细胞核物质不显色，含有细胞核的细胞荧光色清晰，可非常明确的加以区分。可选地，所述鉴定方法还包括：用细胞核染色剂对所述样本进行染色处理，并观察细胞核形态，将细胞核形态呈圆形或椭圆形规则形态的细胞排除出目标细胞。实验证明细胞核形态呈圆形或椭圆形规则形态的细胞非胎儿滋养层细胞。本专利技术还提供了一种胎儿滋养层细胞的检测试剂盒，其包括：荧光标记的HK2抗体物质。可选地，所述试剂盒还包括细胞核染色剂。可选地，所述胎儿滋养层细胞的检测试剂盒还包括微孔阵列芯片。用于使样品呈单细胞分散，便于后续检测和分离。可选地，所述荧光标记的HK2抗体物质是HK2抗体，或者是HK2一抗与二抗的组合，其中所述HK2抗体被荧光素或其他荧光物质标记，所述HK2一抗与二抗的组合中HK2二抗被荧光素或其他荧光物质标记。可选地，所述细胞核染色剂选自细胞核荧光染料，优选，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或Hoechst系列染料。可选地，所述胎儿滋养层细胞的检测试剂盒用于检测孕期妇女生物样本中的胎儿滋养层细胞，所述生物样本宫颈粘液样本或外周血样本。本专利技术还提供了上述胎儿滋养层细胞标志物在制备用于孕期诊断胎儿遗传性疾病的产品中的应用。本专利技术提供的技术方案能够在孕早期妇女的宫颈粘液样本或血液样本中，较为灵敏可靠地检测到胎儿滋养层细胞，尤其可用于孕早期产前诊断。附图说明图1是本专利技术所述胎儿滋养层细胞鉴定方法的流程图；图2是实施例的1号样本细胞悬液所加载的微孔阵列芯片的360号编号区域的图像；图3是实施例的1号样本细胞悬液所加载的微孔阵列芯片的154号编号区域的图像；图4是图2对应的HK2荧光抗体染色图；图5是图2对应的细胞核DAPI染色图；图6是图3对应的HK2荧光抗体染色图；图7是图3对应的细胞核DAPI染色图；图8是实施例的1号样本中部分HK2阳性且DAPI阳性的细胞的DAPI染色图；图9是实施例的1号样本中1至80中细胞的HK2信号值统计分布图；图10是实施例的1-5号样本中的目标细胞的Y染色体鉴定电泳图；图11是实施例的1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HK2在胎儿滋养层细胞鉴定或分离中的应用，其特征在于，所述HK2作为胎儿滋养层细胞的生物标志物。/n

【技术特征摘要】
1.HK2在胎儿滋养层细胞鉴定或分离中的应用，其特征在于，所述HK2作为胎儿滋养层细胞的生物标志物。


2.一种胎儿滋养层细胞的鉴定方法，其特征在于，包括：用荧光标记的HK2抗体物质对含有胎儿滋养层细胞的样本进行染色处理，然后进行荧光检测，若HK2阳性的细胞就是目标细胞。


3.根据权利要求2所述胎儿滋养层细胞的鉴定方法，其特征在于，所述样本由孕期妇女宫颈粘液或外周血处理获得，处理过程为将宫颈粘液经液化或富集后的外周血制备成单细胞悬液，并将单细胞悬液以单细胞形式铺展于微孔阵列芯片或玻璃片，优选微孔阵列芯片。


4.根据权利要求2所述胎儿滋养层细胞的鉴定方法，其特征在于，所述荧光标记的HK2抗体物质是HK2抗体，或者是HK2一抗与二抗的组合，其中所述HK2抗体被荧光素或其他荧光物质标记，所述HK2一抗与二抗的组合中HK2二抗被荧光素或其他荧光物质标记。


5.根据权利要求2所述胎儿滋养层细胞的鉴定方法，其特征在于，还包括：用细胞核染色剂对所述样本进行染色处理，并进行荧光检测，其中HK2阳性且细胞核染色阳性的细胞为目标细胞。通过细胞核染色以排除非细胞物质对所述荧光检测结果的干扰。


6.根据权利要求2所述胎儿滋养层细胞的鉴定方法，其特征在于，还包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：施奇惠，王春英，
申请(专利权)人：苏州浚惠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32