用于肿瘤的己糖激酶2抑制剂液体活检伴随诊断和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于肿瘤的己糖激酶2抑制剂的伴随诊断方法和试剂盒，还提供己糖激酶1抗体与己糖激酶2抗体在该诊断和试剂盒中的应用。通过利用己糖激酶1抗体物质和己糖激酶2抗体物质对肿瘤患者含有肿瘤细胞的体液样本的检测，发现可对己糖激酶2抑制剂敏感的患者，从而进行精准治疗。由于体液比肿瘤组织更易获得，这一检测方式能够免除肿瘤组织活检给患者带来的损伤。带来的损伤。带来的损伤。

【技术实现步骤摘要】
用于肿瘤的己糖激酶2抑制剂液体活检伴随诊断和试剂盒


[0001]本专利技术涉及医学检测领域。具体地，涉及通过液体活检的方式对癌症患者进行己糖激酶2抑制剂伴随诊断，以实现精准医疗的目的。

技术介绍

[0002]能量代谢异常是恶性肿瘤细胞的基本特征之一。肿瘤细胞即使在有氧条件下也倾向于采用糖酵解的代谢方式，这一现象被称为Warburg效应。针对肿瘤细胞有氧糖酵解这一特征，以其中关键的酶作为药物靶点，降低葡萄糖的利用率，阻碍肿瘤细胞生长，一直是癌症治疗与药物开发的思路之一。
[0003]己糖激酶(Hexokinase，HK)是细胞葡萄糖代谢第一步中的关键酶和限速酶，催化葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖。磷酸化的葡萄糖变得不稳定，且无法穿越细胞膜，有利于其在细胞内进一步代谢。在人体中，己糖激酶有5种同工酶，分别为HK1，HK2，HK3，HK4和HKDC1(Hexokinase Domain Containing 1)，其中以HK1与HK2最为重要。HK1在大多数组织中均有表达，被认为是“管家基因”酶。HK2在胎儿组织以及少数成人组织中表达，包括骨骼，心肌和脂肪组织。HK3在几乎所有组织中都以低水平表达，并且受到生理浓度的葡萄糖抑制。HK4又称为葡萄糖激酶，主要在胰腺和肝脏中表达，用于维持血糖的恒定。HKDC1与HK1相邻排列在同一染色体上，与妊娠糖尿病相关。在以上五种己糖激酶中，HK2与肿瘤相关性最大。HK2与HK1相比有更高的催化活性，同时对葡萄糖有很高的亲和力。HK2与线粒体上电压依赖型阴离子孔道蛋白VDAC(Voltage-Dependent Anion Channel)结合，能够优先获得线粒体产生的ATP，使其更能满足肿瘤快速生长的需求。目前研究发现HK2在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等很多肿瘤组织中高表达。正常脑组织己糖激酶的主要亚型是HK1，而神经胶质瘤表达大量的HK2。同样，正常肝组织几乎只表达HK4，在高度恶性的肝癌中，HK4被沉默，取而代之的是HK2及少量HK1。
[0004]针对恶性肿瘤高表达HK2这一特点，目前已经开发了多种HK2抑制剂，但尚未获批进入临床。HK2抑制剂主要有两种类型，第一种是直接利用短发卡RNA降低或沉默HK2；第二种是HK2小分子抑制剂，如3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvic Acid)，它可以使HK2与线粒体上的VDAC分离，抑制HK2活性，最终导致细胞死亡。之前的研究发现HK2抑制剂对于肿瘤的抑制效果取决于肿瘤是否同时表达HK1(如Xu and Herschman,A Tumor Agnostic Therapeutic Strategy for Hexokinase 1
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Null/Hexokinase 2
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Positive Cancers,Cancer Research,2019,DOI:10.1158/0008-5472.CAN-19-1789)。如果肿瘤同时表达较高的HK1，那么即使HK2被完全抑制，肿瘤仍然能通过HK1代谢葡萄糖从而生存。而HK1阴性或很低的肿瘤则对于HK2的基因沉默和抑制剂有显著的应答，比HK1阳性的肿瘤更为敏感。因此，HK2抑制剂被认为主要适用于HK1阴性/很低的肿瘤。根据这一研究结果，可以通过同时检测肿瘤组织中HK1和HK2的量(通过RNA或者蛋白)来判断该肿瘤组织是否属于HK1阴性/很低及HK2阳性的肿瘤，并判断该肿瘤对HK2抑制剂是否敏感，以预判HK2抑制剂对该肿瘤的治疗效果。
[0005]但在临床实践中，常常会遇到无法取到患者肿瘤组织的情况，这时液体活检提供
了一种替代的方法。肿瘤细胞向外播散过程可进入各种体液中，如血液、胸腔积液、脑脊液、尿液等，对这些液体样本中肿瘤细胞的检测被称为液体活检。相比肿瘤组织活检，液体活检更方便，对患者损伤更小，因此越来越被临床所接受。与组织样本不同的是，体液样本中肿瘤细胞的比例往往很低，存在大量良性细胞干扰检测，尤其是这些良性细胞往往高表达HK1且低表达HK2。因此我们无法像对肿瘤组织一样直接、不加区分的检测体液样本中细胞HK1与HK2的值来判断患者肿瘤细胞的HK1与HK2值，而应在体液样本中鉴定出肿瘤细胞，并针对这些肿瘤细胞检测HK1与HK2的值。同时，由于体液中的肿瘤细胞部分已经死亡或者正在凋亡，导致蛋白降解，因此最好在体液样本中鉴定具有活性的肿瘤细胞，并检测其HK1与HK2的值。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种利用肿瘤患者体液样本进行己糖激酶2抑制剂的伴随诊断的方法和试剂。
[0007]本专利技术首先一种针对肿瘤的己糖激酶2抑制剂的伴随诊断方法，包括：用带标记的己糖激酶1(HK1)抗体物质和带标记的己糖激酶2(HK2)抗体物质与患者体液样本细胞中的HK1和HK2蛋白各自形成复合物；以及检测细胞中所述复合物的标记信号，以指示体液样本所含肿瘤细胞及所述肿瘤细胞中HK1和HK2各自的表达水平。
[0008]在本专利技术伴随诊断方法的具体实施方式中，所述体液样本是肿瘤患者的血液、脑脊液、胸腔积液或尿液，更具体地是膀胱癌患者的尿液。
[0009]在本专利技术伴随诊断方法的具体实施方式中，所述形成复合物包括使用带荧光标记的HK1抗体物质和带荧光标记的HK2抗体物质对体液样本细胞进行染色处理；且所述检测包括获取染色处理后细胞的荧光信号，优选地还包括用带标记的，尤其是带荧光标记的，用于排除白细胞的抗体物质对所述细胞进行染色处理。
[0010]本专利技术还提供一种试剂盒，用于针对肿瘤的己糖激酶2抑制剂的伴随诊断，或者说用于本专利技术的伴随诊断方法，其包括：己糖激酶1(HK1)抗体物质和己糖激酶2(HK2)抗体物质，优选地，所述HK1抗体物质和HK2抗体物质是带标记的HK1抗体物质和带标记的HK2抗体物质。本专利技术试剂盒还任选地包括带标记的用于排除白细胞的抗体物质，优选针对白细胞抗原CD45的抗体物质或针对细胞角蛋白的抗体物质。
[0011]本专利技术试剂盒的具体实施方式中，所述HK1抗体物质和HK2抗体物质分别是带标记的HK1抗体和带标记的HK2抗体，或者是HK1抗体与带标记的HK1二抗的组合和HK2抗体与带标记的HK2二抗的组合。所述用于排除白细胞的抗体物质为针对白细胞抗原CD45的抗体或针对细胞角蛋白的抗体。所述标记优选荧光标记。
[0012]本专利技术还涉及己糖激酶1(HK1)抗体物质和己糖激酶2(HK2)抗体物质的组合的应用，包括：在针对肿瘤的HK2抑制剂的伴随诊断中的应用；在制备针对肿瘤的HK2抑制剂伴随诊断的检测试剂中的应用；或者在制备本专利技术试剂盒中的应用。
[0013]在本专利技术涉及的伴随诊断中，将肿瘤细胞的HK1表达水平低于膀胱癌细胞系UMUC-3的HK1表达水平确定为HK1低表达。
[0014]根据本专利技术，通过HK1抗体物质和HK2抗体物质的组合可以在基于样本细胞HK2表达水平检出患者样本中的肿瘤细胞的同时，根据肿瘤细胞的HK1的表达水平判断肿瘤患者
对HK2抑制剂的敏感性，以实现精准治疗。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对肿瘤的己糖激酶2抑制剂的伴随诊断方法，包括：用带标记的己糖激酶1(HK1)抗体物质和带标记的己糖激酶2(HK2)抗体物质与患者体液样本细胞中的HK1和HK2蛋白各自形成复合物；以及检测细胞中所述复合物的标记信号，以指示体液样本所含肿瘤细胞及所述肿瘤细胞中HK1和HK2各自的表达水平。2.如权利要求1所述的伴随诊断方法，其中所述体液样本是肿瘤患者的血液、脑脊液、胸腔积液或尿液，更具体地是膀胱癌患者的尿液。3.如权利要求1所述的伴随诊断方法，其中带标记的HK1抗体物质和带标记的HK2抗体物质分别是带标记的HK1抗体和带标记的HK2抗体，或者分别是HK1抗体与带标记的HK1二抗的组合和HK2抗体与带标记的HK2二抗的组合。4.如权利要求1-3所述的伴随诊断方法，其中非白细胞且HK2高表达的细胞为肿瘤细胞，所述肿瘤细胞HK1低表达或阴性则指示该肿瘤细胞及肿瘤患者对HK2抑制剂敏感。5.如权利要求4所述的方法，其中所述形成复合物包括使用带荧光标记的HK1抗体物质和带荧光标记的HK2抗体物质对体液样本细胞进行染色处理；且所述检测包括获取染色处理后细胞的荧光信号，优选地还包括用带标记的，尤其是带荧光标记的，用于排除白细胞的抗体物质对所述细胞进行染色处理。6.一种试剂盒，用于针对肿瘤的己糖激酶2抑制剂的伴随诊断，其包括：己糖激酶1(HK1)抗体物质和己糖激酶2(HK2)抗体物质，优选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：阎灼辉，
申请(专利权)人：苏州浚惠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：