联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术公开了联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法，涉及生物医药领域，采用抗原抗体夹心法和胶体金免疫层析法原理定性检测人血清或血浆中是否存在抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体，运用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白形成金标N蛋白后吸附在金标垫上，以含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白作为指示标记物，在NC膜的IgM检测线上包被鼠抗人u链单抗、在IgG检测线上包被鼠抗人IgG单抗及在NC膜的质控线上包被鼠抗6×His单抗，实现对抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM/IgG抗体定性检测，具有使用方便、灵敏度高、检测时间短的优点。

Novel coronavirus kit for the detection of IgM/IgG antibodies of new coronavirus and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法
本专利技术属于生物医药领域，涉及联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及其制备方法，具体地说是一种应用夹心法原理的胶体金免疫层析法实现联合对血液中抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体进行定性检测的试剂盒。
技术介绍
2019年12月以来，湖北省武汉市出现了新型冠状病毒（2019-nCoV）疫情，随着疫情的迅速蔓延，我国其他地区及境外多个国家也相继发现了此类病例。其常见体征有发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，而部分患者病症状轻微，甚至存在无临床症状的无症状患者。具备人传人的特点，一般潜伏期1-14天，且潜伏期具有传染性，而无症状感染者也可能成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。疫情发展至今，仍有不少疑似病例因为检测效率不足等原因尚未确诊，如何大规模快速筛查疑似病例，供临床医生快速判断是否为新型冠状病毒肺炎，以便于快速隔离免于传染给更多的人，是亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、简单、可靠、成本低廉、灵敏度高的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法。本专利技术提供技术方案如下：一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴支架，所述粘贴支架上延长度方向依次粘贴有样本垫、金标垫、NC膜、吸样垫，所述NC膜上靠近所述金标垫侧设有IgM检测线和IgG检测线，所述NC膜上靠近所述吸样垫侧设有质控线，所述金标垫含有金标N蛋白，所述金标N蛋白为由胶体金标记的含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白；所述IgM检测线上包被有鼠抗人u链单抗；所述IgG检测线上包被有鼠抗人IgG单抗；所述质控线上包被有鼠抗6×His单抗。作为本专利技术的进一步改进，所述金标N蛋白的制备方法包括以下步骤：S101、胶体金制备：取2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2-5mL1wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；S102、金标液制备：取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.2-7.6，加入15-25μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白充分混匀，再加入100μL10vol%的牛血清白蛋白混匀；S103、金标液纯化：将金标液和金标液混合离心后弃去上清，加入含有20wt%蔗糖的金标复溶液溶解，即得。作为本专利技术的进一步改进，所述金标N蛋白中胶体金的粒径为15-30nm。作为本专利技术的进一步改进，所述质控线上鼠抗6×His单抗的包被浓度为0.75-1mg/ml，所述IgM检测线上鼠抗人u链单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml，所述IgG检测线上鼠抗人IgG单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml。作为本专利技术的进一步改进，所述金标N蛋白中胶体金与含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白在蛋白质的等电点附近进行抗体交联。作为本专利技术的进一步改进，所述金标垫上含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白含量高于所述IgM检测线上鼠抗人u链单抗含量和所述IgG检测线上鼠抗人IgG单抗含量的总量。作为本专利技术的进一步改进，所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜。作为本专利技术的进一步改进，所述的金标垫材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白的处理液处理。一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒的制备方法，包括以下步骤：S1、金标垫的制备：采用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白制得金标N蛋白，并将金标N蛋白喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到金标垫；S2、NC膜的制备：将鼠抗人u链单抗包被在硝酸纤维素膜上形成IgM检测线，将鼠抗人IgG单抗包被在硝酸纤维素膜上形成IgG检测线，将鼠抗6×His单抗包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；S3、切割装配：在粘贴支架的长度方向上依次粘贴样本垫、步骤S1制得的金标垫、步骤S2制得的NC膜以及吸样垫，切割成3.5mm±0.5mm宽的试纸条，装入盒体，即得。作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中，所述金标垫（3）上金标N蛋白的喷涂量为1.4-2.0μL/cm。本申请主要材料：样本垫：材质为玻璃纤维膜，经过样本垫处理液（主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10）处理过夜，样本垫用于去除样品中的大颗粒及缓冲检测系统以保障环境体系中抗原与特异性抗体交联；金标垫：经过专用处理液（含Tris、S-17、牛血清白蛋白等）处理过的玻璃纤维膜，含有金标N蛋白；胶体金标记抗体的确切点样量需要严格测试，以适合IgM检测线显色检测抗新型冠状病毒IgM抗体以及IgG检测线显色检测抗新型冠状病毒IgG抗体，金标N蛋白能分别与抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体特异性结合形成金标复合物，还要使多余胶体金标记抗体进入质控线而显现颜色，金标N蛋白上胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白不足时质控线颜色将不会显示，成为失效条，因此金标垫上含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白含量要高于IgM检测线上鼠抗人u链单抗含量和所述IgG检测线上鼠抗人IgG单抗含量的总量，而过量的金标N蛋白到达T区可出现假阳性，本申请金标垫上金标N蛋白的喷涂量为适宜的1.4-2.0μL/cm；NC膜（硝酸纤维素膜）：在硝酸纤维素膜划线的第一个区是IgM检测线区，在硝酸纤维素膜划线的第二个区是IgG检测线区，在硝酸纤维素膜划线的第三个区是质控线区，IgM检测线、IgG检测线和质控线在此膜包被成线状，IgM检测线包被有鼠抗人u链单抗、IgG检测线包被有鼠抗人IgG单抗，用以捕获胶体金交联复合物，质控线包被鼠抗6×His单抗，当交联复合物从交联垫以毛细运动到达质控线时，该复合物将被鼠抗6×His单抗捕获，而形成可见的酒红色条带，质控线为控制线，以便检验检测系统的有效性，如质控线不出线，表明检验无效；吸样垫：为Whatman滤纸，促进样本层析经过样本垫、胶体金-抗体结合物垫、硝酸纤维素膜，到达吸样垫区，以吸收多余的样本而完成检测；黏贴支架：为PVC支持垫，由薄PVC塑料制成以支撑上述组件。本申请的检测原理：检测时，把待测的血清或血浆样本滴在样品垫上，通过毛细效应下层析向前移动到金标垫，由于未感染的正常人血液中是不存在着抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgM抗体和/或抗新型冠状病毒核衣壳蛋白IgG抗体的（IgM抗体是在急性感染期出现的抗体，患者发病后3天左右就可以阳性，在感染发生后的1到2个月即会消失；IgG是感染中、后期产生的抗体，阳性提示患者处于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴支架（1），所述粘贴支架（1）上延长度方向依次粘贴有样本垫（2）、金标垫（3）、NC膜（4）、吸样垫（5），所述NC膜（4）上靠近所述金标垫（3）侧设有IgM检测线（41）和IgG检测线（42），所述NC膜（4）上靠近所述吸样垫（5）侧设有质控线（43），其特征在于：所述金标垫（3）含有金标N蛋白，所述金标N蛋白为由胶体金标记的含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白；/n所述IgM检测线（41）上包被有鼠抗人u链单抗；/n所述IgG检测线（42）上包被有鼠抗人IgG单抗；/n所述质控线（43）上包被有鼠抗6×His单抗。/n

【技术特征摘要】
1.联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴支架（1），所述粘贴支架（1）上延长度方向依次粘贴有样本垫（2）、金标垫（3）、NC膜（4）、吸样垫（5），所述NC膜（4）上靠近所述金标垫（3）侧设有IgM检测线（41）和IgG检测线（42），所述NC膜（4）上靠近所述吸样垫（5）侧设有质控线（43），其特征在于：所述金标垫（3）含有金标N蛋白，所述金标N蛋白为由胶体金标记的含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白；
所述IgM检测线（41）上包被有鼠抗人u链单抗；
所述IgG检测线（42）上包被有鼠抗人IgG单抗；
所述质控线（43）上包被有鼠抗6×His单抗。


2.根据权利要求1所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于，所述金标N蛋白的制备方法包括以下步骤：
S101、胶体金制备：取2mL1wt%氯金酸加入100mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2-5mL1wt%柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；
S102、金标液制备：取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.2-7.6，加入15-25μg含有6×His标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白充分混匀，再加入100μL10vol%的牛血清白蛋白混匀；
S103、金标液纯化：将金标液离心后弃去上清，加入含有20wt%蔗糖的金标复溶液溶解，即得。


3.根据权利要求1所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述金标N蛋白中胶体金的粒径为15-30nm。


4.根据权利要求1所述的联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒，其特征在于：所述质控线（43）上鼠抗6×His单抗的包被浓度为0.75-1mg/ml，所述IgM检测线（41）上鼠抗人u链单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml，所述IgG检测线（42）上鼠抗人IgG单抗包被浓度为1.0－1.5mg/ml。

【专利技术属性】
技术研发人员：王胜岚，马玉兰，吴伟铭，肖慧芳，范洁云，
申请(专利权)人：中山生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44