检测血液中瑞舒伐他汀的方法技术

本发明专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法包括：制备瑞舒伐他汀标准储备液、制备瑞舒伐他汀的标准中间液、制备内标工作液、制备标准溶液和利用液相色谱‑质谱联用仪检测标准溶液，拟合得到瑞舒伐他汀对应的标准曲线方程为：y

The method of detecting rosuvastatin in blood

【技术实现步骤摘要】
检测血液中瑞舒伐他汀的方法
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种检测血液中瑞舒伐他汀的方法。
技术介绍
瑞舒伐他汀是一种选择性HMG-CoA还原酶抑制剂。HMG-CoA还原酶抑制剂是转变3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A为甲戊酸盐-胆固醇的前体-的限速酶。瑞舒伐他汀的主要作用部位是肝-降低胆固醇的靶向器官。瑞舒伐他汀增加了肝LDL细胞表面受体数目，促进LDL的吸收和分解代谢，抑制了VLDL的肝合成，由此降低VLDL和LDL微粒的总数，故对瑞舒伐他汀的监测具有重要的临床意义。目前，检测服用瑞舒伐他汀的患者的血液样本时，通常采用高效液相色谱法进行测试。但是，通过上述方法检测血液样本中的瑞舒伐他汀含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，萃取。由于萃取处理的时间通常较长，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。
技术实现思路
本申请的专利技术目的是提供了一种检测血液中瑞舒伐他汀的方法，能够提高血液样本的检测效率。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定(a)制备瑞舒伐他汀标准储备液精确称取瑞舒伐他汀标准品2.0mg置于7mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于2mL，得到瑞舒伐他汀标准储备液，在-80℃条件下保存；(b)制备瑞舒伐他汀的标准中间液用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释上述瑞舒伐他汀标准储备液，制成含有浓度为2.5ng/mL～500ng/mL的瑞舒伐他汀的至少三种瑞舒伐他汀的标准中间液，并在-80℃条件下保存；(c)制备内标工作液用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释匹伐他汀-d5储备液，得到一种含有10～50ng/mL匹伐他汀-d5的内标工作液，并在-80℃条件下保存；(d)制备标准溶液分别移取10μL上述至少三种浓度的瑞舒伐他汀标准中间液，在上述每一种瑞舒伐他汀标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和90μL的空白血浆，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，加入200μL的沉淀蛋白试剂乙腈，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，静置5min～10min后，在10000～15000rpm的转速下高速离心5min～10min，得到上清液，上述上清液再在10000～15000rpm的转速下高速离心5min～10min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；(e)拟合标准曲线方程利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的瑞舒伐他汀和匹伐他汀-d5的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积和匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积与匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的瑞舒伐他汀的浓度与匹伐他汀-d5的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到瑞舒伐他汀对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，并且得到权重系数a和b；(二)待测血液样本的处理取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；移取步骤(c)的匹伐他汀-d5的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入200μL沉淀蛋白试剂乙腈，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合1min后，静置5min，再在12000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液，取上清液200μL移至另一个1.5mL离心管中，再在12000rpm的转速下高速离心5min，得到上清液即为待测血液样本；(三)待测血液样本的检测利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积和匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积与匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的瑞舒伐他汀的浓度与匹伐他汀-d5的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，匹伐他汀-d5的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的瑞舒伐他汀浓度。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：在步骤(b)中，制备八种含有不同浓度瑞舒伐他汀的标准中间液，它们分别是含有2.5、5、10、20、50、100、200、500ng/mL瑞舒伐他汀浓度的标准中间液。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：在步骤(b)和步骤(d)中，所述甲醇稀释液为纯甲醇溶液，在步骤(a)中，用纯甲醇溶解瑞舒伐他汀标准品。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：在步骤(c)中，用纯甲醇稀释液稀释匹伐他汀-d5储备液，得到一种含有20ng/mL匹伐他汀-d5的内标工作液。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱；柱温为室温；流动相为：含有0.1％甲酸水溶液和乙腈，上述水溶液与乙腈梯度洗脱时间不小于3.5min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～5000V。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：所述C18反向色谱柱为AgilentPoroshell120EC-C18。本专利技术的检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSICOLPRE-FILTERWATER1/160.5M。本专利技术具有如下有益效果：1、在本专利技术一实施例中，利用液相色谱-质谱联用仪分别检测至少三种浓度的标准溶液，其中，标准溶液为具有内标物的瑞舒伐他汀的标准溶液，且至少三种浓度标准溶液中内标物浓度一致；根据至少三种浓度标准溶液的检测结果，分别拟合瑞舒伐他汀的标准曲线方程；对待检测血液进行高速离心处理，并向离心后的上清液中加入与标准溶液中相同量的内标物工作液，在高转速下涡旋振荡混合，再加入沉淀蛋白试剂，并再次进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，上清液再次进行高速离心处理，以使溶液混合均匀获得去除干扰物后的上清液。利用液相色谱-质谱联用仪检测该上清液，基于瑞舒伐他汀的第一检测结果和瑞舒伐他汀的标准曲线方程，得到待测血液样本中瑞舒伐他汀的浓度，实现了检测血液中的瑞舒伐他汀，有效地缩短了检测时间。2、在本专利技术一实施例中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其特征在于：它包括以下步骤：/n(一)标准溶液的标定/n(a)制备瑞舒伐他汀标准储备液/n精确称取瑞舒伐他汀标准品2.0mg置于7mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于2mL，得到瑞舒伐他汀标准储备液，在-80℃条件下保存；/n(b)制备瑞舒伐他汀的标准中间液/n用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释上述瑞舒伐他汀标准储备液，制成含有浓度为2.5ng/mL～500ng/mL的瑞舒伐他汀的至少三种瑞舒伐他汀的标准中间液，并在-80℃条件下保存；/n(c)制备内标工作液/n用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释匹伐他汀-d5储备液，得到一种含有10～50μg/mL匹伐他汀-d5的内标工作液，并在-80℃条件下保存；/n(d)制备标准溶液/n分别移取10μL上述至少三种浓度的瑞舒伐他汀标准中间液，在上述每一种瑞舒伐他汀标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和90μL的空白血浆，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，加入200μL的沉淀蛋白试剂乙腈，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，静置5min～10min后，在10000～15000rpm的转速下高速离心5min～10min，得到上清液，上述上清液再在10000～15000rpm的转速下高速离心5min～10min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；/n(e)拟合标准曲线方程/n利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的瑞舒伐他汀和匹伐他汀-d5的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积和匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积与匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y...

【技术特征摘要】
1.一种检测血液中瑞舒伐他汀的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备瑞舒伐他汀标准储备液
精确称取瑞舒伐他汀标准品2.0mg置于7mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于2mL，得到瑞舒伐他汀标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备瑞舒伐他汀的标准中间液
用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释上述瑞舒伐他汀标准储备液，制成含有浓度为2.5ng/mL～500ng/mL的瑞舒伐他汀的至少三种瑞舒伐他汀的标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
用含水量为0％～30％甲醇稀释液稀释匹伐他汀-d5储备液，得到一种含有10～50μg/mL匹伐他汀-d5的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述至少三种浓度的瑞舒伐他汀标准中间液，在上述每一种瑞舒伐他汀标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和90μL的空白血浆，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，加入200μL的沉淀蛋白试剂乙腈，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，静置5min～10min后，在10000～15000rpm的转速下高速离心5min～10min，得到上清液，上述上清液再在10000～15000rpm的转速下高速离心5min～10min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的瑞舒伐他汀和匹伐他汀-d5的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积和匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的瑞舒伐他汀的色谱峰峰面积与匹伐他汀-d5的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的瑞舒伐他汀的浓度与匹伐他汀-d5的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到瑞舒伐他汀对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，并且得到权重系数a和b；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的匹伐他汀-d5的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入200μL沉淀蛋白试剂乙腈，在2000...

【专利技术属性】
技术研发人员：雒琴，贾永娟，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11