基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种分子生物学领域，尤指一种基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒，试剂盒包括DNA提取试剂与PCR反应液；PCR反应液包括人SMN1与SMN2基因定量检测的引物、内参RPP30基因检测的引物、人SMN1与SMN2基因检测探针与内参RPP30基因检测探针；本发明专利技术采用引物扩增特异性、灵敏度以及重复性均较高；使用的探针提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力；微滴数字PCR可直接检测目标序列的拷贝数，受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高，检测方式具有更高的准确性及重复性，可应用于SMA携带者筛查、临床确诊和疾病分型等。

Human SMN1 and SMN2 gene copy number detection kit based on digital PCR

【技术实现步骤摘要】
基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒
本专利技术涉及一种分子生物学领域，尤指一种基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)属常染色体隐性遗传神经退行性病变，是由SMN1基因的纯和缺失或突变所致，SMN1基因存在于染色体5q11-5q13区。SMA疾病是仅次于囊泡纤维症居于第二位的遗传性致死性疾病，婴儿发病率为1:6000到1:10000之间，每40～60人中有1位杂合子携带者。2018年5月11日国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》（国卫医发〔2018〕10号）已将SMA收录其中，从国家层面上对这些疾病给予重点关注。临床上根据疾病的严重程度和发病年龄将SMA分成不同的亚类型，0型是最为严重的一种类型，病人需要从出生或出生后不久便开始进行呼吸辅助，通常在短短几周内死亡。最常见的类型是Ⅰ型（又名Werdnig–Hoffmanndisease），一般在6个月之前发病，病情严重。这些患儿无法独自站立并且一般2年内就会走到人生的终点。Ⅱ型属于中等严重型，发病年龄一般集中在6-18个月，患儿通常能够自主站立。此种类型患儿平均寿命会有所缩短，主要是由于呼吸系统的诸多并发症，尽管存在一系列残疾，但大部分都能成年。Ⅲ型（又名Kugelberg–Welanderdisease）通常出现在3岁左右，患者能够行走并且具有正常的平均寿命。最后，Ⅳ型是SMA中最温和的一种，一般成年才发病，具有正常的平均寿命以及相对更好的生存质量。所有SMA有着不同程度的临床表型但却有着相同的遗传缺陷——SMN1的纯合缺失或点突变，导致SMN功能蛋白的缺失。人类拥有独一无二的SMN1基因拷贝——SMN2，该基因与SMN1基因相比，几乎具有相同的编码序列。但是在外显子7的开始处存在一个核苷酸的差异，导致大多数SMN2的转录本具有不同的可变剪接。正常情况下，SMN1的剪接会形成全长mRNA并翻译成全长SMN蛋白（294个氨基酸，32kDa）。在SMN1中外显子7的5'末端的位点CAGACAA代表外显子剪接增强子（ESE）序列，该序列与剪接因子的结合有关，促进外显子7的在剪接过程中的保留，从而形成全长SMN1蛋白。如果序列中的C变成了T将会使SMN2与SMN1变得不同，导致外显子剪接抑制因子（ESS）的形成，其通过异质核核糖核蛋白A1（hnRNPA1）结合促进外显子7在剪接过程中的排除，并且导致SMN2Δ7mRNA和不稳定的SMNΔ7蛋白的产生。内含子剪接沉默子N1（ISS-N1）含有两个hnRNPA1结合位点，并且比外显子序列中的C至T转换具有更强的外显子7排除效应。Nusinersen和其他的反义寡核苷酸（ASOs）靶向ISS-N1，从而阻止与hnRNPA1的结合并促进外显子7的在剪接时的保留和全长SMN蛋白的产生。研究表明，SMN1缺失突变携带频率存在差异，亚洲人的携带频率最高达2.4％。SMN基因座所在区域位于人5号染色体上的一个反转重复区，该区域包含一个SMN1的旁系同源基因SMN2。SMN2在所有SMA患者中都是完整的。然而，在一般人群中，SMN2拷贝数存在0和4个拷贝数的变化。SMA患者携带至少1个SMN2拷贝。95%或以上的SMA患者为SMN1的7号外显子缺失导致。SMN2拷贝数的多少则与SMA表型的轻重相关，SMN2拷贝数越多，产生的SMN蛋白也越多，病情越轻。检测SMN1/2基因的拷贝数是SMA携带者筛查和临床确诊、分型的重要手段。传统检测SMN基因第7外显子(ex7)拷贝数的方法包括聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)。PCR-RFLP只能检测SMN1第7外显子纯合缺失的情况，不能检测含有1个拷贝的携带者，也无法进行疾病分型。MLPA能检测第7外显子的纯合缺失、含有1个拷贝的携带者，和2个拷贝的正常人，但操作复杂，试剂昂贵，不容易临床推广应用。目前也有一些商业化试剂盒，通过荧光定量方法来定量检测SMN1基因拷贝数的变化，但对于表型轻重以及区分1个拷贝和2个拷贝的情况，荧光定量的方法首先要做标准曲线，而且无法同时检测SMN1与SMN2，这就使得临床在检测少量样本时试剂成本明显上升。数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，它的原理是将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，经PCR扩增后，生物芯片阅读仪对微液滴逐个进行荧光强度检测。与阴性微液滴相比，包含核酸分子的阳性微液滴的荧光信号强度增加。最后根据泊松分布的原理，通过阳性微液滴的比例计算出目标核酸分子的绝对拷贝数。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术旨在公开一种分子生物学领域，尤指一种基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供了一种基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括DNA提取试剂与PCR反应液；其中PCR反应液包括人SMN1与SMN2基因定量检测的引物、内参RPP30基因检测的引物、人SMN1与SMN2基因检测探针与内参RPP30基因检测探针。优选地，所述人SMN1与SMN2基因定量检测的引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示；所述内参RPP30基因检测的引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示。优选地，所述人SMN1与SMN2基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；所述内参RPP30基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。优选地，所述人SMN1与SMN2基因检测探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团并连接MGB修饰基团，人SMN1与SMN2基因检测探针的一个碱基还进行锁核酸修饰；作为优选方式，所述荧光报告基团为FAM、TET、VIC或HEX；所述非荧光淬灭基团为NFQ。作为优选方式，本专利技术的人SMN1与SMN2基因检测探针采用的淬灭基团是非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度；且探针是锁核酸修饰的TaqManMGB特异探针；突变型探针的第7个碱基进行锁核酸修饰。优选地，所述人SMN1与SMN2基因定量检测的引物、内参RPP30基因检测的引物的浓度分别为10～50μm/L，更优选浓度为20μm/L。优选地，所述人SMN1与SMN2基因检测探针、内参RPP30基因检测探针的浓度分别为5～30μm/L，更优选浓度为10μm/L。优选地，所述PCR反应液还包括用于微滴数字PCR的PCR预混液MasterMix。优选地，所述DNA提取试剂为QIAampDNABloodMiniKit。优选地，所述试剂盒的应用包括以下：1）从待测样品中提取D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括DNA提取试剂与PCR反应液；其中PCR反应液包括人SMN1与SMN2基因定量检测的引物、内参RPP30基因检测的引物、人SMN1与SMN2基因检测探针与内参RPP30基因检测探针；/n其中，所述人SMN1与SMN2基因定量检测的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2所示；所述内参RPP30基因检测的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；/n所述人SMN1与SMN2基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述内参RPP30基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括DNA提取试剂与PCR反应液；其中PCR反应液包括人SMN1与SMN2基因定量检测的引物、内参RPP30基因检测的引物、人SMN1与SMN2基因检测探针与内参RPP30基因检测探针；
其中，所述人SMN1与SMN2基因定量检测的引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示；所述内参RPP30基因检测的引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示；
所述人SMN1与SMN2基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示；所述内参RPP30基因检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。


2.根据权利要求1所述的基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述人SMN1与SMN2基因检测探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团并连接MGB修饰基团。


3.根据权利要求1所述的基于数字PCR法的人SMN1与SMN2基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述人SMN1与SMN2基因定量检测的引物、内参RPP30基因检测的引物的浓度分别为10～50μm/L。
<...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗景燕，许少飞，陈伟虹，赖炳权，
申请(专利权)人：广东永诺医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44