本发明专利技术涉及以FAPα和survivin为基础的DNA及其在制备肿瘤疫苗中的应用，属于肿瘤DNA疫苗领域。包含可分泌表达的FAPα片段和survivin片段的融合序列SEQ ID NO:1以及以SEQ ID NO:1序列为基础构建的DNA疫苗在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。本发明专利技术通过抗肿瘤实验确定了上述DNA疫苗相比具有单独FAPα和survivin疫苗具有更强的抗肿瘤活性，在小鼠乳腺癌和胰腺癌模型上展现出了良好的抗肿瘤效果，因此SEQ ID NO:1序列在制备各类肿瘤疫苗中具有更好的应用前景。
DNA based on FAP \u03b1 and Survivin and its application in the preparation of tumor vaccine
【技术实现步骤摘要】
以FAPα和survivin为基础的DNA及其在制备肿瘤疫苗中的应用
本专利技术涉及肿瘤DNA疫苗领域。具体地说，本专利技术涉及靶向FAPα和survivin的重组DNA载体CpVR-OsFS在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
技术介绍
癌症已成为严重危害人类健康的重大疾病。目前肿瘤治疗的主要方式包括手术治疗、化疗和放疗。但是传统治疗方式会对患者生理造成不可逆创伤和生理及心理的次生损害，而且还不能完全治愈癌症。因此，迫切需要新的癌症治疗方式，来减轻病人疼痛和提高病人生存质量，并且最终达到治愈。近年来以PD-1和PD-L1为代表的免疫检查点阻断疗法的临床成功，开启了癌症免疫治疗的新纪元。但是同大多免疫疗法一样，免疫检查点阻断疗法有效的前提是要有肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞。作为癌症免疫治疗的重要组成部分，癌症疫苗因其能诱导大量的肿瘤特异性CD8+T细胞而成为研究热点。然而，由于肿瘤微环境(tumormicroenvironment，TME)的存在，疫苗诱导产生的特异性CD8+T细胞不能有效进入到肿瘤内部来杀伤肿瘤，同时由于TME中的免疫抑制因素(如免疫抑制细胞：Treg-调节性T细胞，MDSC-骨髓来源的抑制性细胞等；免疫抑制分子：IL-10，TGF-β等)的存在，使得进入瘤内的T细胞也无法发挥有效的抗肿瘤效果。因此，找到一种能在破坏TME的同时，又能杀伤肿瘤细胞的治疗手段，将是理想且有效的癌症治疗方法。CAFs(cancer-associatedfibroblasts)作为TME的重要组成部分，通过产生调节ECM(extracellularmatrix)的可溶性因子，在肿瘤的生长、进展和转移过程中发挥着重要作用，而且CAFs分泌的胶原蛋白还可以阻碍化疗药物的吸收和CD8+T细胞的浸润。成纤维激活蛋白α(Fibroblastactivationproteinα，FAPα)作为CAFs表面的重要标记，被发现在90％以上的上皮癌中高表达(如乳腺癌、胰腺癌、肺癌等)，且与病人的不良预后相关。并且，删除FAPα+CAFs来调节肿瘤微环境消除免疫抑制因素，可以显著提高癌症疫苗的抗肿瘤效果。另外，凋亡抑制蛋白家族成员survivin在60多种肿瘤中高表达，在正常组织中除了胚胎组织中有表达外正常终末分化组织中均不表达，而且其与预后不良、药物抗性和病人生存期缩短呈正相关。因此，生存素(survivin)是一个非常理想的针对肿瘤细胞的靶抗原。因此，如能构建一种可以同时靶向FAPα和survivin的肿瘤疫苗，既可通过杀伤FAPα+CAFs降低TME中免疫抑制因素，增强CD8+T细胞的浸润，进而提高CD8+T细胞杀伤表达survivin的癌症细胞的效率，达到一箭双雕的效果。目前国内外未见同时以FAPα和survivin为靶点的肿瘤疫苗，但已有研究证明靶向FAPα可以显著提高其他疗法，包括免疫疗法的抗肿瘤效果，因此推测这种策略是可行的。例如StephenGottschalk等人证明清除FAPα+CAFs，可提升疫苗在小鼠黑色素瘤模型上的抗肿瘤效果。ElizabethK.Duperret等人的研究表明，靶向FAPα的DNA疫苗可以重塑肿瘤基质并增强肿瘤疫苗的抗肿瘤效果。国内MeihuaChen等人研制的表达有FAPα的瘤苗，在黑色素瘤，肺癌，结直肠癌等小鼠模型上具有良好的抗肿瘤效果，且显著延长了小鼠的生存期。我们在前期研究中，开发出了一种新型FAPα肿瘤疫苗，在提高了疫苗免疫原性的同时，促进更多的T细胞浸润到肿瘤内部，且显著降低了TME中的免疫抑制因素，如MDSC、Treg等。
技术实现思路
本专利技术提供一种以FAPα和survivin为基础的DNA及其在制备肿瘤疫苗中的应用，构建了它们的DNA疫苗，提供了靶向FAPα和survivin的DNA疫苗在抗肿瘤治疗中的应用。本专利技术采取的技术方案是：本专利技术所述的一种SEQIDNO:1所示的OsFSDNA序列，所述序列包含一段Kozak序列，一段分泌信号肽tPA序列，截短的FAPα核苷酸序列，以及抗凋亡活性缺失的截短的survivin核苷酸序列。本专利技术所述的一种SEQIDNO:1所示的OsFSDNA片段，与原始序列相比进行了密码子优化。本专利技术还包括上述DNA序列制备的DNA疫苗及其在抗肿瘤免疫治疗中的应用。本专利技术所述疫苗包括表达所述DNA序列的重组DNA疫苗及其衍生疫苗。本专利技术所述的DNA疫苗包含一种SEQIDNO:1所示的OsFSDNA序列。本专利技术所述的DNA疫苗的载体骨架为CpVR，在所述CpVR载体上以多克隆酶切位点的连接方式插入SEQIDNO:1所示的DNA序列。本专利技术所述插入的多克隆位点为PstI/BamHI。本专利技术所述疫苗包括所述DNA片段的病毒载体疫苗、树突状细胞疫苗，包含由所述DNA片段转录出的RNA制备的RNA疫苗、包含由所述的DNA片段生产的蛋白类疫苗以及上述疫苗的衍生疫苗。本专利技术所述产品中还可包括免疫佐剂和、或化疗药物；优选地，其中所述的免疫佐剂包括但不限于CpG、IL-2、IFN-γ、可溶性PD-1/PD-L1分子，其中所述的化疗药物包括但不限于多柔比星、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、尼莫司汀、紫杉醇、顺铂、奥沙利铂。本专利技术的优点在于新序列包含有肿瘤微环境基质抗原(FAPα)和肿瘤相关抗原(survivin)，其可以在动物体内同时激起针对肿瘤微环境基质和肿瘤细胞的免疫反应，达到对肿瘤的双重杀伤效果。这种联合方式未见报道，并且以上述序列为基础构建的DNA疫苗比单独抗原序列DNA疫苗具有更强的抗肿瘤活性，这为基于肿瘤微环境基质抗原FAPα和肿瘤相关抗原survivin的DNA疫苗、蛋白疫苗、病毒载体疫苗、RNA疫苗、树突状细胞疫苗的构建和应用奠定了基础。另外，因为DNA疫苗是通过其携带的基因编码的蛋白抗原来诱导机体免疫系统从而发挥功效的，此次，使用本专利技术中的DNA疫苗所编码的蛋白序列所制备的产品也在本专利技术的范围内。同时，密码子具有简并性，即不同的核酸序列可编码出相同的氨基酸序列。因此，通过密码子简并性而对本专利中的序列进行改变也在本专利技术的范围内。附图说明图1：DNA疫苗载体CpVR；图2：DNA疫苗CpVR-OsFS，该重组质粒为DNA序列SEQIDNO:1于CpVR载体中形成；图3：CpVR-OsFS真核表达鉴定，CpVR载体(阴性对照)、CpVR-OsF(阳性对照)、CpVR-OsFS转染293T细胞后通过蛋白印记法证明目的蛋白表达；图4：CpVR-OsFS在小鼠4T1乳腺癌模型上的抗肿瘤效果探究的免疫策略，小鼠4组，每组5只，在攻瘤后7、9、12天进行免疫，第23处死小鼠进行检测；图5：小鼠的平均肿瘤体积生长情况，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第11天开始，每隔两天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值+SD，(***P<0.001,****P<0.0001)；图6：检测小鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，在攻瘤本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA序列，其特征在于：来源于人源成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)和人源生存素(survivin)。/n
【技术特征摘要】
1.一种DNA序列，其特征在于：来源于人源成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)和人源生存素(survivin)。
2.根据权利要求1所述的DNA序列为OsFS，其特征在于，包含一段Kozak序列，一段分泌信号肽tPA序列，截短的FAPα核苷酸序列，以及截短的survivin核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.权利要求1、2所述的DNA序列或其变体序列即可以编码出相同氨基酸序列的DNA序列，DNA序列的RNA转录产物或可以翻译出相同蛋白序列的RNA序列，或与权力要求1，2项所述的DNA序列编码的蛋白序列一致的氨基酸序列，由上述序列生产的蛋白类制品在制备防治肿瘤的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品中包括疫苗。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述疫苗包括表达权利要求1、2中DNA序列的重组DNA疫苗及其衍生疫苗；
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：其中的DNA疫苗包...
【专利技术属性】
技术研发人员：张海红，于湘晖，孔维，耿飞，郭杰，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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