打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及动物模型构建领域，公开了一种打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用，本发明专利技术克服了现有树突状细胞清除动物模型的不足，提供了一种能稳定传代的新型可诱导型的、白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DC SIGN‑DTR转基因小鼠动物模型的制备、使用和检测方法。本发明专利技术构建得到的白喉毒素调控清除单核细胞衍生DC的DCSIGN‑DTR转基因小鼠动物模型单核细胞衍生DC清除效率达80％‑90％，能够较好地清除单核细胞衍生DC，且在不用白喉毒素诱导时单核细胞衍生DC功能不受影响，利用白喉毒素诱导清除单核细胞衍生DC时无副反应，提供了一种全新的单核细胞衍生DC清除的原理和方法，提供了一种全新的单核细胞衍生DC可诱导清除的动物模型。

Construction method and application of target vector and diphtheria toxin regulating and clearing monocyte derived dendritic cells in transgenic mice

【技术实现步骤摘要】
打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用
本专利技术涉及动物模型构建领域，更具体地，涉及一种打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用。
技术介绍
树突状细胞(dendriticcells，MDC)是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞，是唯一能激活未致敏的初始T细胞的抗原体提呈细胞，是启动、调控、并维持免疫应答中心。树突状细胞起源于骨髓中的造血干细胞，一方面髓样干细胞可以分化为髓样DC，又称DC1，包括朗格汉斯细胞，间质DC以及单核细胞衍生DC；另一方面，淋巴样干细胞可以分化为淋巴样DC，又称DC2。当外周血中的单核细胞可以在GM-CSF和IL-4的刺激下分化为DC，组织中处于稳态的DC能自我更新，而不需要单核细胞衍生DC的补充。在外周血和骨髓中，单核细胞的数量大约是DC的20倍，并且单核细胞衍生DC作为DC的一个主要部分，其功能是不能被忽视的。为了研究单核细胞衍生DC的功能，一个重要的实验就是在体内清除单核细胞衍生DC，然而现在未有能够特异性清除单核细胞衍生DC的动物模型，所以开发能够特异性清除单核细胞衍生DC的动物模型具有重要作用。白喉毒素受体-白喉毒素(DTR-DT)系统是近年来发展起来的一种用于诱导特定细胞群凋亡的系统。白喉毒素(DT)是白喉棒状杆菌产生的一种毒素，包含A和B两个亚基，而白喉毒素受体(DTR)又称人类肝素结合的表皮生长因子样生长因子(hbEGF)。当DT通过B亚基与DTR结合时，整个毒素将通过受体介导的内吞作用内化，毒素的亚单位A随后可抑制蛋白质的翻译，导致细胞凋亡而死亡。啮齿类动物的hbEGF因为3个氨基酸的变化，对DT的亲和力比人类低103-105倍，所以给小鼠注射DT可以特异性诱导表达DTR(即人类hbEGF)的细胞群体凋亡，从而特异性清除该细胞群体，并且无明显副反应。树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(dendriticcellspecificintercellular-adherison-molecular-3grabbingnon-integr，DC-SIGN)是一种主要表达于DC表面的模式识别受体，属于C型凝集素超分子家族。所以我们选择DC-SIGN作为驱动DTR表达的基因构建转基因小鼠，这样在表达DC-SIGN的单核细胞衍生DC中会表达DTR，而不表达DC-SIGN的组织中自我更新DC或其他非DC细胞中不表达DTR，注射合适剂量的DT就可以选择性地诱导单核细胞衍生DC凋亡。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的树突状细胞清除动物模型的不足，提供一种打靶载体及白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的转基因小鼠的构建方法和应用。本专利技术的目的是提供一种靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点，构建白喉毒素调控清除单核细胞衍生树突状细胞的DCSIGN-DTR转基因小鼠的方法和应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现：一种带小鼠DC-SIGN长同源臂的整合外源基因IRES-DTR的打靶载体，所述靶向打靶载体序列如SEQIDNO.8所示，命名为pL253-DCSIGN5HAL-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HAL-MCL-HSVTK。一种提取载体，所述提取载体序列如SEQIDNO.7所示，命名为载体pL253-retrieval5HA-retrieval3HA-MCL-HSVTK。S1.构建带长同源臂的靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的打靶载体，命名为打靶载体pL253-DCSIGN5HAL-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HAL-MCL-HSVTK；S2.电穿孔法将酶切线性化的打靶载体导入小鼠胚胎干细胞BALB/CES细胞，得到靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的BALB/CES细胞；S3.利用靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的BALB/CES细胞，囊胚注射法构建靶向插入IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的DCSIGN-DTR转基因小鼠；其中S1步骤所述构建带长同源臂的靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点的打靶载体的具体方法如下：(1)以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.3所示的基因片段DC-SIGN5’侧同源臂(retrieval5HA)；以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段DC-SIGN3’侧同源臂(retrieval3HA)；(2)将retrieval5HA和retrieval3HA利用酶切位点NotI、SpeI、BamHI克隆至带阴性选择标记HSVTK的载体pL253-retrivied-empty(counter-SelectionBACModificationKit,Genebridges)，得到序列如SEQIDNO.7所示的提取载体pL253-retrieval5HA-retrieval3HA-MCL-HSVTK；(3)电穿孔法将质粒pRED/ET转化入BACCloneDCSIGN-IRES-DTR-PEN(由本实验室构建，正在申报专利，部分基因结构如附图1所示)，并用L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达；(4)电穿孔法将利用SpeI酶切线性化的pL253-retrieval5HA-retrieval3HA-MCL-HSVTK提取载体转化入上述表达RED/ET的BACCloneDCSIGN-IRES-DTR-PEN，同源重组得到序列如SEQIDNO.8所示的带有DC-SIGN5’同源臂(～2kb)和3’同源臂(～20kb)的打靶载体，命名为打靶载体pL253-DCSIGN5HAL-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HAL-MCL-HSVTK；(5)挑选单克隆，利用序列如SEQIDNO.9所示的正向引物和序列如SEQIDNO.10所示的反向引物作菌落PCR，成功提取IRES-DTR-PGK-EM7-NEO和DC-SIGN同源臂的载体能够得到约1.2kb的条带。至此，我们得到打靶载体pL253-DCSIGN5HAL-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HAL-MCL-HSVTK。上述打靶载体可用于靶向整合外源基因IRES-DTR至DC-SIGN外显子7位点，如小鼠胚胎干(ES)细胞DC-SIGN外显子7位点。本专利技术还提供利用上述打靶载体靶向整合外源基因IRES-DTR至小鼠胚胎干细胞DC-SIGN外显子7位点的方法，即步骤S2。具体步骤如下：(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)用MEF培养基培养，经30Grayγ射线灭活处理后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带小鼠DC-SIGN长同源臂的整合外源基因IRES-DTR的打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为pL253-DCSIGN 5HA L-IRES-DTR-PEN-DCSIGN 3HA L-MCL-HSV TK。/n

【技术特征摘要】
1.一种带小鼠DC-SIGN长同源臂的整合外源基因IRES-DTR的打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQIDNO.8所示，命名为pL253-DCSIGN5HAL-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HAL-MCL-HSVTK。


2.一种用于构建如权利要求1所述打靶载体的提取载体，其特征在于：所述提取载体序列如SEQIDNO.7所示，命名为载体pL253-retrieval5HA-retrieval3HA-MCL-HSVTK。


3.一种提取载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.3所示的基因片段DC-SIGN5’侧同源臂；以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段DC-SIGN3’侧同源臂；
(2)将retrieval5HA和retrieval3HA利用酶切位点NotI、SpeI、BamHI克隆至带阴性选择标记HSVTK的载体pL253-retrivied-empty，得到序列如SEQIDNO.7所示的提取载体pL253-retrieval5HA-retrieval3HA-MCL-HSVTK。


4.一种打靶载体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)电穿孔法将质粒pRED/ET转化入BACCloneDCSIGN-IRES-DTR-PEN，并用L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达；
(2)电穿孔法将利用SpeI酶切线性化的pL253-retrieval5HA-retrieval3HA-MCL-HSVTK提取载体转化入上述表达RED/ET的BACCloneDCSIGN-IRES-DTR-PEN，同源重组得到序列如SEQIDNO.8所示的带有DC-SIGN5’同源臂(～2kb)和3’同源臂(～20kb)的打靶载体，命名为打靶载体pL253-DCSIGN5HAL-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3H...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛剑鹏，梁廷波，白雪莉，汤江辉，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33