人源化细胞因子CSF1基因改造非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及人源化基因改造非人动物，具体涉及表达人源化细胞因子蛋白的一种人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。具体涉及表达人或人源化CSF1蛋白的动物模型。在一些例子中，表达人CSF1蛋白的经遗传修饰的非人动物还含有IL2rg缺失，和/或含有IL3、CSF2等更多基因人源化。

Construction method and application of csf1 gene transformation in non-human animals

【技术实现步骤摘要】
人源化细胞因子CSF1基因改造非人动物的构建方法及应用
本申请涉及人源化CSF1基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化细胞因子CSF1蛋白改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
细胞的分化、发育、增殖乃至活化，均受到多个细胞因子信号的协同作用，其中巨噬细胞集落刺激因子M-CSF(Macrophage-colonystimulatingfactor，又称colony-stimulatingfactor1，CSF1)是骨髓祖细胞分化为单核细胞谱系细胞(monocytelineagecells)，如巨噬细胞，破骨细胞和小胶质细胞所必须的细胞因子，在单核巨噬细胞的存活、增殖、分化及维持活性促进造血功能中具有重要作用。除了此之外，已有研究表明CSF1在破骨细胞的分化、雌性生殖道细胞的分化、胎盘的形成及血管和淋巴的发育过程也有重要作用，并做为促炎因子参与炎性反应，是肿瘤和炎症的有效标志。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。已有研究表明作为受体鼠，目前普遍使用的免疫缺陷动物排序如下：NOD-PrkdcscidIL-2rγnul小鼠〉NOD-Rag1-/--IL2rg-/-〉Rag2-/--IL2rg-/-〉NOD/scid〉裸鼠，表明NOD-PrkdcscidIL-2rγnul小鼠是目前最佳的移植受体鼠(ItoRetal.CellMolImmunol.2012May；9(3):208-14)。一个理想的免疫系统人源化小鼠不仅要有人源的多谱系免疫系统，还应该使各细胞亚群的比例与人类接近，且具有功能。尽管NOD-PrkdcscidIL-2rγnull小鼠机体免疫功能严重缺陷，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化小鼠模型研发，但由于鼠的细胞因子不能很好的作用于人的造血细胞，在移植人造血干细胞后，人源细胞的发育和功能上存有缺陷(WatanabeYetal.,IntImmunol.2009Jul；21(7):843-58)。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的发展方向。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(ScheerN,SnaithM,WolfCR,SeiblerJ.Generationandutilityofgeneticallyhumanizedmousemodels,DrugDiscovToday；18(23-24):1200-11,2013)。百奥赛图公司已经成功制备了NOD-PrkdcscidIL-2rγnull小鼠(命名为B-NDG小鼠)，为了进一步优化已有模型，解决临床转换方面存在的不足和需求，本领域急需制备新的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，提供了一种人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体内表达人或人源化CSF1蛋白。优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列。更优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括人CSF1基因的外显子1至外显子8的部分或全部，所述的人CSF1基因通过内源性调控元件调控，使得该非人动物体内表达人CSF1蛋白。优选的，所述的外显子1至外显子8的部分为至少30、60、90个与人CSF1基因的核苷酸序列相同，且人源化CSF1基因改造非人动物体内产生的CSF1蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。进一步优选的，所述的外显子1至外显子8的部分或全部包含人CSF1基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7或外显子8核苷酸序列中的任一种或两种或三种以上的组合。所述的三种以上包括三种、四种、五种、六种、七种或八种。再进一步优选的，所述的外显子1至外显子8的部分或全部包含人CSF1基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7或外显子8核苷酸序列中连续两个或连续三个以上外显子核苷酸序列的组合。所述的连续三个以上包括连续连续三个、连续四个、连续五个、连续六个、连续七个或连续八个。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括人CSF1基因的外显子1的部分核苷酸序列、外显子2的全部核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列、外显子7的全部核苷酸序列和外显子8的部分核苷酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体的基因组中包括人CSF1基因的外显子1的起始密码子至外显子8的终止密码子的核苷酸序列。本专利技术所述的构建方法中使用基因编辑技术进行人源化CSF1基因改造非人动物的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。进一步优选的，使用靶向CSF1基因的sgRNA序列将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的内源调控元件之后。更进一步优选的，插入位点为起始密码子。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用靶向CSF1基因的sgRNA序列将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的起始密码子前或者用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换非人动物CSF1基因的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，并使得所述人源化非人动物体内表达人CSF1蛋白；其中，所述的sgRNA序列在待改变的CSF1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则；优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQIDNO：9-17任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：18-26任一项所示。进一步优选的，使用靶向载体将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的内源调控元件之后。更进一步优选的，插入位点为起始密码子。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用靶向载体将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的起始密码子前或者用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换非人动本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体内表达人或人源化CSF1蛋白。/n

【技术特征摘要】
20181225 CN 20181159205461.一种人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体内表达人或人源化CSF1蛋白。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列，优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括人CSF1基因的外显子1至外显子8的部分或全部，所述的人CSF1基因通过内源性调控元件调控，使得该非人动物体内表达人CSF1蛋白。


3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向CSF1基因的sgRNA序列和/或靶向载体用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换非人动物CSF1基因的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，使得所述人源化非人动物体内表达人CSF1蛋白；
其中，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列；
所述的sgRNA序列在待改变的CSF1基因上的靶序列上是唯一的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQIDNO：9-17任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：18-26任一项所示。


4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1基因改造非人动物基因组中包括嵌合CSF1基因，所述的嵌合CSF1基因编码人或人源化CSF1蛋白；所述的嵌合CSF1基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
b)与SEQIDNO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
c)具有SEQIDNO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
d)来源于人CSF1基因的部分为与SEQIDNO：8或SEQIDNO：3所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)来源于人CSF1基因的部分为与SEQIDNO：8或SEQIDNO：3所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
f)来源于人CSF1基因的部分为具有SEQIDNO：8或SEQIDNO：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
g)编码的氨基酸序列与SEQIDNO：4所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)编码的氨基酸序列与SEQIDNO：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
i)编码的氨基酸序列具有SEQIDNO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
j)转录的mRNA序列与SEQIDNO：48或SEQIDNO：49所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
k)转录的mRNA序列与SEQIDNO：48或SEQIDNO：49所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
l)转录的mRNA序列具有SEQIDNO：48或SEQIDNO：49所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


5.一种CSF1基因经遗传修饰的细胞，其特征在于，所述的细胞表达人或人源化CSF1蛋白。


6.一种CSF1基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。


7.根据权利要求6所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；或者，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸，优...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭雅南，白阳，黄蕤，尚诚彰，张美玲，姚佳维，郭朝设，
申请(专利权)人：百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32