激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法技术

本发明专利技术公开了一种激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法，选择不含增强子且转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子，通过体外重组技术，在所述靶启动子之前插入UCOE截断序列，在所述靶启动子的下游插入一个表达靶向所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框,构建最终载体，最终载体能使靶启动子表达框内的EGFP基因表达量持续稳定高效表达，得以克服转基因沉默效应；本发明专利技术所述方法可以应用于抗体及蛋白药物的工业化生产领域或基因治疗，提高生产效率，降低生产成本，具有良好的社会效益和经济效益。

Activating RNA regulatory promoter to overcome the silencing effect of transgene

【技术实现步骤摘要】
激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法
本专利技术属于生物
，涉及用于重组抗体或蛋白药物生产等的表达载体及其构建方法，尤其涉及一种利用激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法。
技术介绍
重组抗体和蛋白药物是近年来临床上使用的特效药，但由于其昂贵的价格，限制了其广泛的应用。在重组抗体及蛋白药物的成本构成中，生产效率低仍然是重要因素。而在重组抗体及蛋白药物繁杂的生产环节中，载体是否能高效地表达是影响生产效率的关键技术因素之一。虽然对于高效表达载体的解决方案有很多，但集中的问题仍然是克服转基因表达中的位置效应和沉默效应。转化外源基因的宿主细胞需要在生物反应器中经历数十天甚至更长生产周期的持续稳定表达，沉默效应机制往往导致转到细胞中表达的载体过早地被抑制，因此实现转基因在哺乳动物细胞中的持续高效生产，仍然是基因工程细胞生产的主要技术难题。转基因沉默效应主要与染色质重塑、组蛋白修饰和DNA甲基化等因素相关。位置效应是由于重组基因不恰当地插入到异染色体附近时，插入的外源序列被染色体形成机构重新打包并组装成高度浓缩的核小体，从而抑制其转录，因此位置效应常常导致严重的沉默效应。克服转基因沉默效应有很多方法，但效果不尽相同，在工业上也远未形成标准。遍在染色质开放元件（UCOE）可以在启动子上形成开放染色质。开放染色质通常是细胞结构上呈解聚状态，位于间期核中心，在细胞周期的早期进行复制，其组蛋白高度乙酰化，相连DNA的CpG二核苷酸通常无甲基化。启动子上开放染色质受特定的调控元件调控，主要有两种调控元件，包括能建立和维持转录专一的开放染色质结构，行使组织特异的或遍在基因表达模式的遗传调控元件；以及通过物理阻隔形成开放染色质边界的绝缘子（insulator）或障碍元件(Antoniou，etal,2003)。目前已明确具备建立和维持转录专一开放染色质结构功能的遗传控制元件是遍在染色质开放元件（ubiquitouschromatinopeningelements，UCOE）(Antoniou，etal,2003)。在哺乳动物细胞表达载体中,大多采用在启动子附近添加调节序列,如UCOE,S/MAR等调节序列，以干预启动子附近的表观修饰,克服转基因沉默效应。但是这些调节序列所发挥的作用诱导的表达量上调能力有限，仍不能满足生产需要，并且其调节效果对不同的启动子也不一样，使得最后呈现的效果不稳定或不可控，影响生产应用。激活RNA是区别于RNA干扰(RNAi)的RNA调控方法。RNA激活是通过双链RNA针对基因的启动子进行靶向作用，进而通过影响转录调控机构或表观遗传调控机制增加基因表达，这种针对基因启动子起激活作用的小RNA称为小激活RNA(saRNA)。小激活RNA靶向的启动子区域存在染色质重塑的现象。RNA的激活可形成整合基因启动子区域的持续开放状态，从而有利于外源基因克服转基因的沉默效应，获得持续稳定的表达。虽然UCOE序列和小激活RNA单独作用时都能使其调控的启动子区域形成开放染色质，进而激活启动子下游基因的表达，但二者单独作用时的效果比较有限，而UCOE序列和小激活RNA共同作用于同一启动子以克服转基因沉默效应的相关技术未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对目前存在的重组抗体及蛋白表达载体表达效率低的问题，提供一种利用激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法，以此构建出持续稳定高效表达的载体，满足工业上的生产和推广使用，降低重组抗体及蛋白药物的成本。为了解决以上所述技术问题，本专利技术所述激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法包括以下步骤：（1）选择不含增强子且转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子，用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ；（2）在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框上游AseI酶切位点插入UCOE截断序列，构建中间载体Ⅱ；（3）在所述中间载体Ⅱ的外源基因表达框下游，插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，获得最终载体；所述表达激活RNA基因的shRNA基因表达框的序列见表一；所述最终载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。进一步，本专利技术所述靶启动子为人源SOX2基因启动子。进一步，本专利技术所述构建中间载体Ⅰ的步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：SOX2＃正向引物：CCGTGATTAAT(AseI)AGACAAGGAAGGTTTTGAGGACSOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(AgeI)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT。本专利技术所述“CG含量高或CpG岛”指的是DNA序列的CG（即二核苷酸）含量占全部碱基比例≥60%的情况。本专利技术通过激活RNA与UCOE序列在特定启动子（不含增强子且转录起始位点上含有CpG岛的启动子，即所述靶启动子）上发生相互作用，以此构建重组载体（最终载体），最终载体在转染CHO细胞32天以上的周期内持续稳定表达，且表达量明显高于单独使用UCOE序列或单独使用激活RNA进行调控的对照载体，证明激活RNA和UCOE二者在克服转基因沉默效应上存在叠加效应。将本专利技术所述方法应用于重组蛋白及药物生产、基因工程、基因治疗等领域，可极大地降低成本。本专利技术的有益效果：本专利技术利用UCOE序列和激活小RNA一起对靶启动子共同作用，更能在克服转基因沉默效应的应用中发挥作用，通过该技术方案获得的最终载体，可激活下游基因在长达32天后仍然高效表达，其表达量明显高于现有技术中惯用的单独用UCOE调控或单独用小激活RNA调控时的表达量，本专利技术提供了一种新的更为有效的克服转基因沉默效应的方法。附图说明图1为所述中间载体ⅠpSOX2的结构示意图；图2为所述中间载体ⅡpSOX2-UCOE的结构示意图；图3为实施例所述对照载体pSOX2-S278的结构示意图；图4为所述最终载体pSOX2-U-S278的结构示意图；图5为ELISA分析测试重组载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278的表达量,并与商业载体pEGFP-C1中EGFP蛋白表达量对比图（注：带*的载体表示该载体与其它载体表达的EGFP浓度值值之间存在差异时,P<0.05,统计差异显著）；图6为qRT-PCR定量法检测各个表达载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278相对商业载体pEGFP-C1的EGFP基因表达量的对比图（注：带*的载体表示该载体与其它载体中表达的EGFP相对倍数值之间存在差异时,P<0.05,统计差异显著**表示p<0.01）；图7为重组载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278与商业载体pEGFP-C1的荧光强度测试结果对比分析图（注：带*的载体表示该载体与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n选择不含增强子且转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子，用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ；/n（2）在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入UCOE截断序列，构建中间载体Ⅱ；/n（3）在所述中间载体Ⅱ的外源基因表达框下游，插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，获得最终载体；所述表达激活RNA基因的shRNA基因表达框的序列见表一；/n表一：/n

【技术特征摘要】
1.一种激活RNA调控启动子克服转基因沉默效应的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
选择不含增强子且转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子，用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体Ⅰ；
（2）在所述中间载体Ⅰ的外源基因表达框上游AseI酶切位点插入UCOE截断序列，构建中间载体Ⅱ；
（3）在所述中间载体Ⅱ的外源基因表达框下游，插入针对所述靶启动子的表达激活RNA基因的shRNA基因表达框，获得最终载体；所述表达激活RNA基因的shRNA基因表达框的序列见表一；
表一：



所述最终载体经验...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，刘凌云，殷旭东，王德斌，翟书华，范志伟，
申请(专利权)人：昆明学院，
类型：发明
国别省市：云南;53