本发明专利技术属于生物技术领域，主要是一种打靶载体及整合外源基因至小鼠DC‑SIGN外显子7位点构建BAC克隆的方法和应用，一种靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.14所示，命名为打靶载体pL451‑DCSIGN 5HA‑IRES‑DTR‑PEN‑DC SIGN 3HA。本发明专利技术提供了一个新的能实现靶向整合的位点序列，利用该位点可构建靶向插入外源基因的打靶载体，并验证了利用该打靶载体能高效整合外源基因至小鼠DC‑SIGN BAC克隆DC‑SIGN外显子7位点，后续得到的靶向插入外源基因的DC‑SIGN BAC，可以用于构建靶向插入外源基因的小鼠胚胎干细胞，从而为构建转基因细胞系以及小鼠建立了基础。
Construction of BAC clone by targeting vector and integrating foreign gene into exon 7 of DC-SIGN in mice
【技术实现步骤摘要】
打靶载体及整合外源基因至小鼠DC-SIGN外显子7位点构建BAC克隆的方法和应用
本专利技术属于生物
，主要是一种打靶载体及整合外源基因至小鼠DC-SIGN外显子7位点构建BAC克隆的方法和应用。
技术介绍
通过同源重组将外源基因定点整合至靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，这种技术称为基因打靶技术。利用基因打靶技术将外源基因靶向整合至特定的染色体位点在基因疗法、细胞工程、遗传动物模型、基因功能研究及药物开发等中具有重要应用价值，而所有这些应用一方面依赖于转入基因功能的可靠性和可预测性，另一方面要求转入基因不影响内源基因和或其他调控因子的功能。树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(dendriticcellspecificintercellular-adherison-molecular-3grabbingnon-integr，DC-SIGN)是一种主要表达于树突状细胞(DC)表面的模式识别受体，属于C型凝集素超分子家族。研究发现，当外周血中的单核细胞可以在GM-CSF和IL-4的刺激下分化为DC，组织中处于稳态的DC能自我更新，而不需要单核细胞衍生DC的补充。有趣的是，单核细胞衍生DC表达DC-SIGN而组织中自我更新的DC不表达。所以DC-SIGN可以作为一个基因敲入的位点，使外源基因在单核细胞衍生DC中特异性表达，在其他细胞中不表达。而且我们把插入位点设置在DC-SIGN基因终止密码子之后，并利用IRES启动外源基因表达，最小化外源基因插入对细胞功能的影响。细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome，BAC)是指一种以F质粒为基础建构而成的细菌染色体克隆载体。在基因打靶技术中，为了保证同源重组的效率需要长片段的同源臂，而直接克隆长片段的同源臂较为困难。作为一个基因保存的载体，BAC可以克隆约150kb的DNA且具有遗传背景简单的特点。我们可以将需要靶向插入的外源基因利用短同源臂先导入相应的BAC克隆，然后提取BAC进一步作为基因打靶的载体，以提高基因打靶的效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供打靶载体及整合外源基因至DC-SIGN外显子7位点构建靶向插入外源基因的小鼠DC-SIGNBAC克隆的方法和应用。本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的。一种靶向打靶载体序列如SEQIDNO.14所示，命名为打靶载体pL451-DCSIGN5HA-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HA；该载体能将外源基因IRES-DTR及抗性基因Neomycin靶向整合至DC-SIGN外显子7位点终止密码子之后。靶向整合后IRES-DTR由DC-SIGN启动子调控被转录，外源基因DTR在IRES的调控下被翻译，且不影响DC-SIGN表达，抗性基因Neomycin在PGK(哺乳动物)和EM7(大肠杆菌)的调控下被表达。如需要表达其它基因，只要将外源基因DTR替换成感兴趣的基因。上述靶向打靶载体的制备方法包括如下步骤：(1)以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物进PCR，扩增出序列如SEQIDNO.3所示的基因片段DCSIGN5’侧同源臂(DCSIGN5HA)；(2)将目的基因片段DCSIGN5HA利用酶切位点KpnI、SalI克隆至带阳性选择标记的载体pL451-targeted-empty(counter-SelectionBACModificationKit,Genebridges)，得到中间载体pL451-DCSIGN5HA-PEN。(3)以pLVX-EF1α-IRES-mCherry质粒(addgene)为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段IRES；以pIRES-proHBEGFWT质粒(addgene)为模板，利用序列如SEQIDNO.7所示的正向引物和序列如SEQIDNO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.9所示的基因片段DTR；OverlapPCR得到序列如SEQIDNO.10所示的融合基因片段IRES-DTR；(4)将目的基因片段IRES-DTR利用酶切位点SalI、EcoRI克隆至中间载体pL451-DCSIGN5HA-PEN，得到中间载体pL451-DCSIGN5HA-IRES-DTR-PEN。(5)以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.11所示的正向引物和序列如SEQIDNO.12所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.13所示的基因片段DC-SIGN3’侧同源臂(DCSIGN3HA)；(6)将目的基因片段DCSIGN3HA利用酶切位点BamHI、NotI克隆至中间载体pL451-DCSIGN5HA-IRES-DTR-PEN，得到序列如SEQIDNO.14所示的打靶载体pL451-DCSIGN5HA-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HA。上述靶向打靶载体可用于靶向整合外源基因至DC-SIGN外显子7位点构建小鼠DC-SIGNBAC克隆。本专利技术还提供利用上述打靶载体，靶向整合外源基因至DC-SIGN外显子7位点，构建靶向插入外源基因的小鼠DC-SIGN-DTRBAC克隆的方法。具体步骤如下：(1)电穿孔法将Red/ET表达质粒pRED/ET转化入DC-SIGNBAC克隆，在有氯霉素和四环素抗性的LB平板上筛选，挑取单菌落扩增，并用L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达；(2)打靶载体pL451-DCSIGN5HA-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HA利用NotI酶切线性化，电穿孔法将线性化的载体转化入上述表达Red/ET的DC-SIGNBAC克隆，使IRES-DTR-PGK-EM7-Neo靶向插入DC-SIGNBAC；(3)成功插入IRES-DTR-PGK-EM7-Neo的DC-SIGNBAC克隆表达新霉素抗性，用有新霉素和氯霉素的LB平板筛选得BAC克隆DCSIGN-IRES-DTR-PEN；(4)挑选单克隆，利用序列如SEQIDNO.15所示的正向引物和序列如SEQIDNO.16所示的反向引物作菌落PCR，成功插入IRES-DTR-PGK-EM7-Neo的DC-SIGNBAC克隆能够得到约1.4kb的条带。SpeI酶切鉴定阳性BAC克隆可见4-6kb间多出2条带。至此，本专利技术提供了靶向打靶载体及靶向整合外源基因至DC-SIGN外显子7位点，构建靶向插入外源基因的小鼠DC-SIGNBAC克隆的制备和检测方法。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种高效、安全靶向整合外源基因至小鼠DC-SIGNBAC克隆DC-SIGN外显子7位点的方法和应用实例。本专利技术提供了靶向小鼠DC-SIGN外显子7位点的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.14所示，命名为载体pL451-DCSIGN 5HA-IRES-DTR-PEN-DC SIGN 3HA。/n
【技术特征摘要】
1.一种靶向打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQIDNO.14所示，命名为载体pL451-DCSIGN5HA-IRES-DTR-PEN-DCSIGN3HA。
2.一种靶向打靶载体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物进PCR，扩增出序列如SEQIDNO.3所示的基因片段DCSIGN5’侧同源臂；
(2)将目的基因片段DCSIGN5HA利用酶切位点KpnI、SalI克隆至带阳性选择标记的载体pL451-targeted-empty，得到中间载体pL451-DCSIGN5HA-PEN；
(3)以pLVX-EF1α-IRES-mCherry质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段IRES；以pIRES-proHBEGFWT质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.7所示的正向引物和序列如SEQIDNO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.9所示的基因片段DTR；OverlapPCR得到序列如SEQIDNO.10所示的融合基因片段IRES-DTR；
(4)将目的基因片段IRES-DTR利用酶切位点SalI、EcoRI克隆至中间载体pL451-DCSIGN5HA-PEN，得到中间载体pL451-DCSIGN5HA-IRES-DTR-PEN；
(5)以RP23-12K14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.11所示的正向引物和序列如SEQIDNO.1...
【专利技术属性】
技术研发人员：盛剑鹏，梁廷波，白雪莉，汤江辉，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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