本发明专利技术涉及一种重组人白介素11突变体，其氨基酸序列是在SEQ ID NO:1的基础上，进行如下三点突变N50R/L67K/S145A。该突变体能以超过野生型IL11蛋白40倍以上的亲和力结合IL11Rα受体，同时能够抑制gp130的二聚化激活，并且动物实验证实其能够明显的缓解小鼠肝纤维化，能用于非酒精性脂肪肝病的治疗，有着广阔的药用前景。
IL-11 mutant and its application in the treatment of liver fibrosis
【技术实现步骤摘要】
白细胞介素11突变体及其在治疗肝纤维化中的应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体的涉及白细胞介素11突变体及其在治疗肝纤维化中的应用。
技术介绍
当前全球约25％的人患有非酒精性脂肪肝病，虽然非酒精性脂肪肝病可以好转，但治疗不及时将会导致其恶化成非酒精性肝炎[1]。非酒精性肝炎以肝脏炎症、肝细胞死亡、肝纤维化为特点，最终导致肝硬化、肝癌的产生。其中肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞转化是造成非酒精性肝炎的重要原因[2-5]。许多因素可以激活HSC细胞，使其转化成肌成纤维细胞，其中包括促纤维化因子TGFB1、PDGF[6,7]以及一些促炎因子CCL2、TNFA、CCL5等[4,7,8]，但靶向这些上游分子会造成严重的副作用[1,9]。针对非酒精性肝炎的治疗，还有一些靶向代谢的药物，但目前在改善肝纤维化方面未取得良好的效果[1,9]。而最新的研究表明抑制IL11信号通路能够降低肝细胞死亡以及肝纤维化的发生[10]。同时IL11作为TGFB1的下游，作为靶向分子副作用较小，因此IL11成为治疗肝纤维化的理想靶点。IL11由多种不同的组织分泌产生，包括胸腺、中枢神经系统、皮肤和结缔组织、肺、骨等，是一种多效细胞因子，可直接作用于、巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞和肝细胞等，具有促进巨核细胞和血小板生成、调控免疫、抗炎和保护粘膜上皮等功能[11]。ILll开始以前体的形式在细胞中合成，前体由199个氨基酸组成，其中前21个氨基酸是信号肽，将信号肽切除后，形成由178个氨基酸组成的成熟IL11，分泌到胞外，发挥其生物学功能。通过对IL11的三维结构研究，表明其是由4个α螺旋和连接α螺旋的loop环组成的四螺旋束状结构。A螺旋包括第37-56位氨基酸，B螺旋包括第92-112位氨基酸，C螺旋包括第125-147位氨基酸，D螺旋包括第173-196位氨基酸，相应的AB螺旋之间的loop环包括第57-91位氨基酸，BC螺旋之间的loop环包括第113-124位氨基酸，CD螺旋之间的loop环包括第148-172位氨基酸。IL11蛋白表面形成三个受体结合位点[12,13]，结合位点I参与其与IL11Rα的结合，包括ABloop环的末端和D螺旋的C端氨基酸残基；结合位点II以及结合位点III与gp130的结合有关[14]，其中结合位点II包括从A螺旋到C螺旋的氨基酸残基；结合位点III包括D螺旋的N端以及ABloop环的前端。IL11信号通路的激活依赖IL11与细胞表面受体的结合，IL11的受体(ILIIR)由ILIIRα和gpl30两个糖蛋白链组成，IL11Rα具有结合配体的能力，IL11先以低亲和力结合IL11Rα[15,16]，形成IL11-IL11Rα异源二聚体，该异源二聚体以高亲和力结合gp130形成异源三聚体蛋白。IL11-IL-llRα-gp130异源三聚体同源二聚化形成六聚体[17,18]，进而磷酸化激活下游STAT信号通路或MAPK级联反应[19,20]。最终，IL11通过gp130信号传导链向胞内传递信号，使细胞获得增殖和活化的信号。然而虽然IL11信号通路的机理已经有所研究，但是当前并没有令人满意的的针对IL11靶点的药物出现。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术的提供一种重组人白介素11(IL11)突变体及其制备方法。本专利技术所涉及的突变体除个别氨基酸位点存在突变外，具有与成熟IL11相同的氨基酸序列。所述突变体相较于野生型IL11具有更强的IL11Rα结合能力，同时能够抑制gp130二聚化激活，进而有效阻止IL11信号通路的传导。所述突变体能够抑制或减少TGFB1诱导的HSC细胞激活(即转化成肌成纤维细胞)，证明所述突变体作为野生型IL11的竞争性拮抗剂，起到阻断IL11信号通路的作用。构建小鼠NASH疾病模型，对NASH模型小鼠施用所述突变体，能够降低小鼠肝脏中羟脯氨酸含量，证明所述突变体能够减轻小鼠肝纤维化，达到治疗NASH疾病的目的。本专利技术提供一个技术方案：一种重组人白介素11突变体，其氨基酸序列是在SEQIDNO:1的基础上，进行如下三点突变N50R/L67K/S145A。本专利技术还提供一个技术方案：一种治疗非酒精性脂肪肝病的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的重组人白介素11突变体。本专利技术还提供一个技术方案：本专利技术所述的重组人白介素11突变体在用于制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。本专利技术还提供一个技术方案：本专利技术所述的重组人白介素11突变体在用于制备治疗肝纤维化的药物中的应用。本专利技术还提供一个技术方案：本专利技术所述的重组人白介素11突变体在用于制备结合IL11Rα受体的制剂中的应用。本专利技术还提供一个技术方案：本专利技术所述的权利要求1所述的重组人白介素11突变体在用于制备抑制HSC细胞的激活的制剂中的应用。本专利技术通过对IL11与受体复合物3D结构分析，通过对特定位置的氨基酸进行点突变，达到改变IL11与受体的亲和力，同时改变gp130的信号传导活性的目的。本专利技术利用搭桥法PCR将特定位置的氨基酸进行点突变并构建到pET-21a载体上。将pET-21a-hIL11突变体质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态表达相应突变体蛋白。裂解大肠杆菌及包涵体，再进过盐层析和亲和层析，最终获得相应的突变体蛋白。利用ELISA实验检测突变体蛋白与受体的亲和力；检测细胞上清中collagen的含量反映HSC细胞激活情况。最终筛选到50号位点的天冬酰胺突变成精氨酸，67号位点的亮氨酸突变成赖氨酸，145号位点的丝氨酸突变成丙氨酸后获得的突变体蛋白，能够以超过野生型IL11蛋白40倍以上的亲和力结合IL11Rα受体，同时能够抑制gp130的二聚化激活。接下来研究IL11突变体蛋白的拮抗功能，在存在或不存在IL11突变体的情况下，向HSC细胞培养基中加入TGFB1，已知TGFB1能够刺激IL11的表达，并诱导HSC细胞向肌成纤维细胞转化。结果表明与对照组相比，含有IL11突变体的一组能够有效的抑制HSC细胞的激活，起到拮抗IL11，抑制IL11信号通路激活的作用。饲喂小鼠胆碱-蛋氨酸缺乏的高脂饮食，建立小鼠NASH疾病模型，小鼠皮下注射IL11突变体蛋白3周后，检测小鼠肝脏中羟脯氨酸含量，结果表明注射IL11突变体的小鼠肝脏中羟脯氨酸含量明显下降，即施用IL11突变体能够缓解小鼠肝纤维化。本专利技术的IL11突变体能以超过野生型IL11蛋白40倍以上的亲和力结合IL11Rα受体，同时能够抑制gp130的二聚化激活，能够有效的抑制HSC细胞的激活，起到拮抗IL11，抑制IL11信号通路激活的作用，并且动物实验证实其能够明显的缓解小鼠肝纤维化，能用于非酒精性脂肪肝病的治疗，有着广阔的药用前景。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。图1是pET-21a质粒图谱。将突变后的目的片段插入pET-2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组人白介素11突变体，其特征在于：其氨基酸序列是在SEQ ID NO:1的基础上，进行如下三点突变N50R/L67K/S145A。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组人白介素11突变体，其特征在于：其氨基酸序列是在SEQIDNO:1的基础上，进行如下三点突变N50R/L67K/S145A。
2.一种治疗非酒精性脂肪肝病的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的重组人白介素11突变体。
3.权利要求1所述的重组人白介素11突变体在用于制备治疗非酒精性脂肪肝...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭菲，杨建华，
申请(专利权)人：北京岳昊科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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