一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针及其合成方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针及其制备方法和应用其结构式如Ⅰ式所示：

A reactive free heme specific small molecule fluorescent probe and its synthesis and Application

【技术实现步骤摘要】
一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针及其合成方法和应用
本专利技术属于荧光探针
，涉及一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针及其合成方法和应用。
技术介绍
游离亚铁血红素(Labileheme,LH)是血红素蛋白发挥功能的重要单元，是一种生物体内必不可少的分子。同时，它也可以和细胞中的双氧水作用(Fenton反应)产生高活性氧，进而破坏蛋白以及细胞膜结构，引起细胞凋亡。因此，细胞内的LH是受到严格控制的。当前LH的检测手段主要包括放射性标记法、高效液相色谱分析法、紫外吸收分析法和荧光分析法。但是，这些手段都需要复杂的前处理过程，并不适合于活细胞中的应用研究。而且，它们只能用于血红素总量(蛋白络合亚铁血红素、LH以及高铁血红素)的测定，不能对LH进行精准检测。小分子荧光探针能够有效监测和成像细胞生命活动的相关事件，在过去几十年中，小分子荧光探针已经广泛用于生物目标物的检测。本专利技术旨在构建了一种LH特异性激活的小分子荧光探针，并将其用于复杂体系中LH的成像检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针及其合成方法和应用。本专利技术这种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针，其结构式如Ⅰ式所示：其中：R代表氢和疏水烷基链中的一种。作为优选，反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针，其结构式如Ⅱ式所示：本专利技术这种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将化合物1和三光气加入到双口圆底烧瓶中，惰性气氛保护下注入无水二氯甲烷和无水N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌反应；反应完毕后，真空除去溶剂，接着重新注入无水二氯甲烷和无水N,N-二异丙基乙胺；将化学物2溶于无水二氯甲烷，注入到反应瓶中，室温继续搅拌反应；反应完毕后，减压除去溶剂，采用柱层析分离提纯后，得到小分子荧光探针Ⅰ；合成路线如下：所述的化合物1、三光气和化合物2的摩尔比为1:(2～4):(1.0～1.5)；惰性气氛为氮气或氦气气氛；搅拌反应时间为8～24h，继续搅拌反应时间为6～10h；柱层析过程中采用石油醚和二氯甲烷作为洗脱剂；石油醚和二氯甲烷的体积比为1:(1～5)。所述的小分子荧光探针Ⅰ在体外缓冲溶液中检测LH的应用。所述的小分子荧光探针Ⅰ在活细胞中检测LH的应用。所述的小分子荧光探针Ⅰ在溶血模型中检测LH的应用。本专利技术合成了一种对LH特异性响应的小分子荧光探针。该探针对LH具有较高的灵敏度和选择性，能够区分LH和高铁血红素、蛋白络合亚铁血红素以及金属卟啉衍生物，解决了目前检测手段特异性差的问题。而且，该探针能够检测到细胞内源性LH的含量变化，解决了传统检测方法无法实现活细胞内LH检测的难题。此外，该探针能够用于小鼠溶血模型中LH的检测，为研究LH在相关疾病中的重要作用提供了有用的分子工具。本专利技术与现有技术相比，具有的有益技术效果为：1)本专利技术的荧光探针为小分子荧光探针，合成简单，操作简便；2)本专利技术中荧光探针对LH具有较高的选择性，能够避免高铁血红素、蛋白络合亚铁血红素以及金属卟啉衍生物对检测的干扰；3)本专利技术中荧光探针对LH具有较高的灵敏度；4)本专利技术中荧光探针能够用于活细胞中LH的成像检测；5)本专利技术的荧光探针能够对溶血疾病中LH的含量变化进行成像检测。附图说明图1为实施例2中荧光探针HNG的荧光发射光谱随着LH浓度增加的变化曲线；图2为实施例2中荧光探针HNG与低浓度LH的响应曲线。图3为实施例3中荧光探针HNG对高铁血红素、金属卟啉、血红蛋白、肌红蛋白和过氧化物酶以及亚铁离子的响应情况；(a)探针HNG对不同浓度的高铁血红素和金属卟啉的响应情况；(b)探针HNG对不同浓度的血红蛋白、肌红蛋白和过氧化物酶的响应情况；(c)探针HNG在不同的反应时间对亚铁粒子和LH的响应情况；(d)响应原理图。图4为所述荧光探针对活细胞内源性LH的共聚焦成像图片；(a)细胞共聚焦图片；(b)测得LH的荧光强度图片。图5为所述荧光探针对溶血过程中小鼠肝部荧光成像；(a)肝组织成像图片；(b)肝组织切片双光子共聚焦成像图片；(c)肝组织荧光柱状图；(d)溶血模型中肝组织HE染色图片；(e)溶血模型中肝组织成像图片；(f)溶血模型中肝组织切片双光子共聚焦成像图片；(g)溶血模型中肝组织荧光柱状图具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术作进一步阐述，但本专利技术并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原料如无说明均能从公开商业途径获得。实施例1小分子反应型LH探针HNG的合成将NG(0.28g,1.32mmol)和三光气(0.89g,3.00mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，氮气保护下注入15mL无水二氯甲烷和0.5mL无水N,N-二异丙基乙胺，反应在室温下过夜；真空除去溶剂，重新注入10mL无水二氯甲烷和0.5mL无水N,N-二异丙基乙胺；将化合物2(1.58mmol)溶于5mL无水二氯甲烷中，注入反应瓶中，室温下反应8h；减压除去溶剂，所得固态样采用柱层析分离提纯(洗脱剂为体积比为1:1石油醚和二氯甲烷)得到淡黄色产物即为小分子荧光探针HNG(0.20g,30％)。合成路线如下：HNG的质谱及核磁表征：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.50(d,J＝7.1Hz,1H),8.45(d,J＝8.1Hz,1H),8.23(d,J＝8.1Hz,1H),8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(t,J＝7.8Hz,1H),7.48(s,1H),4.88(m,1H),3.45(s,3H),2.10-1.54(m,22H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ164.38,163.86,152.42,139.15,132.51,131.19,128.71,126.47,126.06,123.17,122.82,117.48,116.70,111.83,108.47,77.38,77.06,76.74,72.66,39.92,36.68,36.32,34.78,34.72,33.73,30.50,26.97,26.83,26.40,19.68.HRMS(ESI)m/zcalcdforC30H32N2O7[M-H],531.2131；Found,531.2157核磁结果与合成路线中HNG的结构式完全符合。实施例2HNG探针在试管里对LH的检测将实施例1制备的HNG探针配成1mM的DMSO储备溶液，于-20℃下保存。LH由高铁血红素在抗坏血酸钠还原作用下获得。检测体系为PBS缓冲溶液(10mM，pH7.4，含10％的DMSO)。将HNG探针与LH的反应体系在37℃下摇荡60分钟，然后测量其荧光发射光谱。设置荧光仪的激发波长为440nm，发射波长接本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针，其特征在于，其结构式如Ⅰ式所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针，其特征在于，其结构式如Ⅰ式所示：



其中：R代表氢和疏水烷基链中的一种。


2.根据权利要求1所述的反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针，其特征在于，其结构式如Ⅱ式所示：





3.根据权利要求1种反应型游离亚铁血红素特异性响应的小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
将化合物1和三光气加入到双口圆底烧瓶中，惰性气氛保护下注入无水二氯甲烷和无水N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌反应；反应完毕后，真空除去溶剂，接着重新注入无水二氯甲烷和无水N,N-二异丙基乙胺；将化学物2溶于无水二氯甲烷，注入到反应瓶中，室温继续搅拌反应；反应完毕后，减压除去溶剂，采用柱层析分离提纯后，得到小分子荧光探针Ⅰ；
合成路线如下：






4.根据权利要求3种反应型游离亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓兵，徐帅，袁婕，刘永超，宦双燕，袁林，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43