具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的用途技术

本发明专利技术涉及瘤孢毁丝霉GH37海藻糖酶的海藻糖酶变体。本发明专利技术还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Polypeptides with trehalase activity and their application in the production of fermentation products

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的用途序列表的引用本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。专利技术背景
本专利技术涉及具有海藻糖酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生这些多肽的方法。本专利技术还涉及使用本专利技术的海藻糖酶生产发酵产物的方法。
技术介绍
本专利技术提供了与其亲本相比具有改进的特性的海藻糖酶变体。海藻糖是由两个糖单体(葡萄糖)组成的稳定的二糖。海藻糖以多至10％-15％的细胞干重作为对应激的响应积累于酵母中(GrBa等人,(1975)Eur.J.Appl.Microbiol.[欧洲应用生理学杂志]2:29-37)。海藻糖不能被酵母代谢。海藻糖酶将海藻糖切割成两个葡萄糖单元。将海藻糖酶分类于EC3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(NomenclatureCommittee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/enzyme/”上。两个酶类别均被称作“海藻糖酶”。中性海藻糖的实例包括来自如下的海藻糖酶：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(Londesborouh等人,(1984)Characterizationoftwotrehalasesfrombaker’syeast[面包酵母两种海藻糖酶的表征]BiochemJ[生物化学杂志]219,511-518；洛氏毛霉(Mucorroxii)(Dewerchin等人,(1984),“TrehalaseactivityandcyclicAMPcontentduringearlydevelopmentofMucorrouxiispores”[洛氏毛霉孢子早期发育过程中的海藻糖酶活性和环状AMP含量],J.Bacteriol.[细菌学杂志],158,575-579)；布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)(Thevelein等人,(1983),“Glucose-inducedtrehalaseactivationandtrehalosemobilizationduringearlygerminationofPhycomycesblakesleeanusspores”[布拉克须霉孢子早期萌发过程中葡萄糖诱导的海藻糖酶活化和海藻糖动员]J.GenMicrobiol.[通用与应用微生物学杂志]129,719-726)；尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporium)(Amaral等人,(1996),“ComparativestudyoftwotrehalaseactivitiesfromFusariumoxysporiumvarLinii”[尖孢镰孢菌林氏变种的两种海藻糖酶活性的比较研究]Can.J.Microbiol[加拿大微生物学杂志].41,1057-1062)。中性海藻糖酶的实例包括，但不限于，来自如下的海藻糖酶：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(Parvaeh等人,(1996)PurificationandbiochemicalcharacterizationoftheATH1geneproduct,vacuolaracidtrehalasefromSaccharomycescerevisae”[酿酒酵母ATH1基因产物液泡酸海藻糖酶的纯化及生化特性]FEBSLett[欧洲生化学会联合会快报].391,273-278)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)(Hecker等人,(1973),“LocationoftrehalaseintheascosporesofNeurospora:Relationtoascosporedormancyandgermination”[海藻糖酶在脉孢菌子囊孢子中的定位：与子囊孢子休眠和萌发的关系].J.Bacteriol.[细菌学杂志]115,592-599)；金黄毛壳菌(Chaetomiumaureum)(Sumida等人,(1989),“PurificationandsomepropertiesoftrehalasefromChaetomiumaureumMS-27”.[金黄毛壳菌MS-27海藻糖酶的纯化及某些性质的研究]J.Ferment.Bioeng.[发酵生物工程杂志]67,83-86)；构巢曲霉(Aspergillusnidulans)(d’Enfert等人,(1997),“MolecularcharacterizationoftheAspergillusnidulanstreAgeneencodinganacidtrehalaserequiredforgrowthontrehalose.[编码在海藻糖上生长所需的酸性海藻糖酶的构巢曲霉treA基因的分子表征]Mol.Microbiol.[分子微生物学]24,203-216)；灰腐质霉(Humicolagrisea)(Zimmermann等人,(1990)”；“PurificationandpropertiesofanextracellularconidialtrehalasefromHumicolagriseavar.thermoidea[来自灰腐质霉高温变种胞外分生孢子海藻糖酶的纯化及特性]”,Biochim.Acta[生物化学与生物物理学报]1036,41-46)；灰腐质霉(Cardello等人(1994),“AcytosolictrehalasefromthethermophilhilicfungusHumicolagriseavar.thermoidea”[来自嗜热真菌灰腐质霉高温变种的胞液型海藻糖酶],MicrobiologyUK[英国微生物学]140,1671-1677；嗜热柱顶孢霉(Scytalidiumthermophilum)(Kadowaki等人,(1996),“CharacterizationofthetrehalosesystemfromthethermophilicfungusScytalidiumthermophilum[来自嗜热真菌嗜热柱顶孢霉的海藻糖系统的表征]”Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1291,199-205)；和尖孢镰孢菌(Amaral等人,(1996),“ComparativestudyoftwotrehalaseactivitiesfromFusariumoxysporiumvarLinii”[尖孢镰孢菌林氏变种的两种海藻糖酶活性的比较研究]Can.J.Microbiol[加拿大微生物学杂志].41,1057-1062)。还已知海藻糖酶来自大豆(Aeschbachet等人,(1999),“PurificationofthetrehalaseGmTRE1fromsoybeannodulesandcloningofitscDNA”[纯化来自大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性的海藻糖酶变体多肽，该海藻糖酶变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置152、182、185或583处的一个或多个位置处的替换，其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％，至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170808 EP 17185362.51.一种具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性的海藻糖酶变体多肽，该海藻糖酶变体多肽包含在对应于SEQIDNO:1的位置152、182、185或583处的一个或多个位置处的替换，其中该变体具有与SEQIDNO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％，至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性。


2.如权利要求1所述的变体，该变体包含一个或多个取代，该一个或多个取代选自于由以下组成的组：P152G、P152E、P152A、F182V、F185R或G583T。


3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性，该变体包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：
G583T；
P152G；
P152E；
P152A；
F182V；
F185R；
P152G+G583T；
F185R+G583T；
P152A+F182V+G583T；
F182V+F185R+G583T；
并且其中该变体具有与SEQIDNO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性，并且其中在30℃，pH4.0下与黑曲霉蛋白酶混合物孵育3天后的残留活性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％。


4.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体具有增加的热稳定性，该变体包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：
P152G；
P152E；
P152A；
F182V；
F185R；
P152G+G583T；
F185R+G583T；
P152A+F182V+G583T；
F182V+F185R+G583T；
并且其中该变体具有与SEQIDNO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性，其中通过TSA分析测量的热变性温度至少为65.7℃。


5.如权利要求4所述的变体，其中该热变性温度为至少65.8℃、至少65.9℃、至少66.0℃、至少66.1℃、至少66.2℃、至少66.3℃、至少66.4℃、至少66.5℃、至少66.6℃、至少66.6℃、至少66.8℃、至少66.9℃、至少67.0℃、至少67.1℃、至少67.2℃、至少67.3℃、至少67.4℃、至少67.5℃。

【专利技术属性】
技术研发人员：堤纪子，松井知子，仓方悠马，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK