一种耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E制造技术

本发明专利技术涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，公开了一种耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E，突变体V322DH328DT329E的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。经15.0～30.0％(w/v)的KCl、Na

An ammonium sulfate resistant xylosidase mutant v322dh328dt329e

【技术实现步骤摘要】
一种耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E
本专利技术属于基因工程
，涉及蛋白质改造技术，具体为一种耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E。
技术介绍
木聚糖是一种半纤维素，广泛存在于植物的细胞壁中，在高等植物和农业废料中约占干重的20％。内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8)作用于木聚糖的主链骨架，可随机地切割木聚糖从而生成低聚木糖，木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC3.2.1.37)可将低聚木糖水解为木糖(Collinsetal.FEMSMicrobiologyReviews,2005,29:3～23.)，木糖可作为微生物等生物利用的碳源，或作为原料生产乙醇、乳酸、木糖醇等。除了木聚糖外，植物的糖蛋白中也含有木糖，其可被木糖苷酶降解(Leszczuketal.PlantPhysiologyandBiochemistry,2019,139:681～690.)；此外，广泛存在于动物体内的蛋白聚糖也含有木糖，其也可被木糖苷酶降解(Takagakietal.TheJournalofBiologicalChemistry,1990,265:854～860.)。盐广泛存在于在自然界和各种生产实践中，包括农业、制革、污水、洗涤、食品、造纸等。例如，氯化钾和硫酸铵是在农业种植中应用相对广泛的一种化肥；在皮革软化过程中，需要添加硫酸钠，在此过程中加入木聚糖酶，可达到促进皮纤维松散，提高成品革的柔软度、手感和物理机械性能的效果(专利：ZL201710574969.3)。不耐盐的木糖苷酶将无法和化肥同时施用，不利于降解农业废料中的低聚木糖，从而导致木聚糖的循环利用降低，进一步导致土壤肥力降低。由于高盐浓度下的盐析作用，大部分的酶在高盐浓度下不具有良好的催化活性。因此，为了使酶在高盐环境生物
具有更好的应用性，需要提高酶在盐中的稳定性。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的旨在提供耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E，V322DH328DT329E可应用于农业、制革、污水处理等行业。为了达到上述技术目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：本专利技术通过蛋白质改造技术，设计了耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E，所述的突变体V322DH328DT329E的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，与GenBank记录的木糖苷酶序列AQM74402(SEQIDNO.3)相比，V322DH328DT329E的第322位、328位和329位氨基酸分别为天冬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，而AQM74402的第322位、328位和329位氨基酸分别为缬氨酸、组氨酸和苏氨酸。所述的突变体V322DH328DT329E在不同盐中的稳定性不同：V322DH328DT329E经3.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，活性剩余63～93％；该突变体经3.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min后，活性剩余60～96％；该突变体经3.0～10.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，活性剩余56～86％，经15.0～30.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，活性为99～107％。本专利技术提供了所述的耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E的编码基因v322dh328dt329e，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的另一目的在于提供包含木糖苷酶突变体V322DH328DT329E编码基因的重组载体。本专利技术的另一目的在于提供包含木糖苷酶突变体V322DH328DT329E编码基因的重组菌。另外，本专利技术所述的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E在农业、制革和污水处理的应用也在本专利技术的保护范围内。本专利技术所述的耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E的制备方法，具体包括以下步骤：1)合成突变体V322DH328DT329E的编码基因v322dh328dt329e(SEQIDNO.2)；2)将(1)中合成的序列和表达载体pEasy-E1相连接，即可获得包含v322dh328dt329e的表达载体；3)将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达突变体V322DH328DT329E的重组菌株；4)培养重组菌株，诱导木糖苷酶突变体V322DH328DT329E表达；5)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E。本专利技术的有益效果为：与野生酶HJ14GH43和突变酶V322D相比，突变酶V322DH328DT329E在高浓度(NH4)2SO4中的稳定性得到了增强。经15.0～30.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，野生酶HJ14GH43的活性从111％降到38％，突变酶V322D的活性从104％降到60％，而V322DH328DT329E的活性几乎没有下降，最低也可达99％。本专利技术的耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E可应用于农业、制革、污水处理等行业。附图说明图1是野生酶HJ14GH43和突变酶V322DH328DT329E的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；W：HJ14GH43；Mut：V322DH328DT329E；图2是纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶V322DH328DT329E在KCl中的稳定性；图3是纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶V322DH328DT329E在Na2SO4中的稳定性；图4是纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶V322DH328DT329E在(NH4)2SO4中的稳定性。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术以下实施例中的实验材料和试剂：1、菌株及载体：大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E1购自北京全式金生物技术有限公司。2、酶类及其它生化试剂：pNP(p-nitrophenol)和pNPX(p-nitrophenyl-β-d-xylopyranoside)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E，其特征在于，所述的突变体V322DH328DT329E由木糖苷酶序列AQM74402第322位的缬氨酸、第328位的组氨酸以及第329位的苏氨酸分别突变为天冬氨酸、天冬氨酸以及谷氨酸得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E，其特征在于，所述的突变体V322DH328DT329E由木糖苷酶序列AQM74402第322位的缬氨酸、第328位的组氨酸以及第329位的苏氨酸分别突变为天冬氨酸、天冬氨酸以及谷氨酸得到。


2.根据权利要求1所述的耐硫酸铵的木糖苷酶突变体V322DH328DT329E，其特征在于，所述的突变体V322DH328DT329E的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.权利要求1或2所述的突变体V322DH328DT329E的编码基因v322dh328dt329e，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的编码基因。


5.一种重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，黄遵锡，张蕊，李娜，韩楠玉，唐湘华，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53