一种壳聚糖酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程改造，具体的说是一种壳聚糖酶突变体及其应用。壳聚糖酶突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A。本发明专利技术所用的壳聚糖酶突变体活性高，耐高温。并对该壳聚糖酶进行理性改造，通过定点突变和增加柔性片段的方法大大提高了其酶活及其热稳定性，使得该酶具有了工业化生产壳寡糖的潜力。

A chitosanase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
一种壳聚糖酶突变体及其应用
本专利技术涉及基因工程改造，具体的说是一种壳聚糖酶突变体及其应用。
技术介绍
壳聚糖是甲壳素脱去乙酰基后的产物，是自然界中唯一存在的碱性多糖，具有生物可降解、对动物无毒害、可溶于酸性溶液、可获得多种物理形式并且更容易处理等特点。壳聚糖在多种领域都有应用，但一般制得的壳聚糖分子量都很大，而大分子壳聚糖不溶于水且不能发挥壳寡糖的一些特殊功能，因此，壳聚糖需要进一步通过化学法或酶法降解成壳寡糖。壳寡糖具有水溶性好、无毒性、与生物体兼容、环境友好型、易被生物体降解等特性，目前广泛用于医药卫生、保健食品、食品加工、化妆品、纺织、环保、农业、饲料等领域。壳聚糖酶可以水解壳聚糖中的β-1，4-糖苷键，将壳聚糖降解。已发现的壳聚糖酶绝大部分为内切酶，可以将壳聚糖降解为壳寡糖。目前研究最多的是来源于细菌和真菌的壳聚糖酶。并且现阶段，制备壳寡糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法等。化学降解法产生的衍生物较多，低聚糖得率低且环境污染严重；物理降解法生产成本较高，难以实现工业化；酶法因条件温和、选择性高，对环境污染小，产物安全性好，受到了越来越多的重视与关注。如今，酶法水解壳聚糖制备壳寡糖已成为甲壳素领域的一个研究热点。酶法降解壳聚糖有诸多的优点，但是这种方法还是存在有待提高的方面，第一方面是壳聚糖酶的酶活力普遍较低；第二方面是酶的热稳定性有待提高。这两方面制约了酶法降解壳聚糖向大规模工业发展。本专利技术涉及的一种来自人体肠道微生物菌株产生的降解壳聚糖的壳聚糖酶，其特征在于酶活力高，热稳定性强，具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术中存在的不足的之处，提供一种热稳定性好、酶活高的壳聚糖酶突变体。一种壳聚糖酶突变体，突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A)，其氨基酸序列如下SEQIDNO:4所示；或，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345PA)，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A/PA)其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。所述壳聚糖酶BC345为人肠道菌BacteroidesclarusYIT12056菌株基因组DNA中壳聚糖酶BC345。一种壳聚糖酶突变体用于降解壳聚糖生产壳寡糖的应用。一种重组质粒，所述重组为含所述壳聚糖酶的基因的质粒。所述质粒载体为pPCIZα。一种含所述重组质粒的基因工程菌株。所述重组质粒转化至毕赤酵母中获得。一种所述基因工程菌株壳聚糖酶用于降解壳聚糖生产壳寡糖的应用。本专利技术所述壳聚糖酶由肠道菌BacteroidesclarusYIT12056(＝DSM22519)获得(该菌株购自日本菌种保藏中心(JapanCollectionofMicroorganism，JCM))，该菌株的基因组数据可以由GenBank:AFBM00000000.1查阅。壳聚糖酶可水解壳聚糖中的β-1,4-糖苷键，将壳聚糖降解。同时，对该酶进行基因改造获得其突变体通过PCR的方法克隆了这种菌基因组DNA上该壳聚糖酶的全长基因，然后转到毕赤酵母中表达该壳聚糖酶，接着通过Ni-柱亲和层析和分子筛方法得到纯化的壳聚糖酶。本专利技术所用的壳聚糖酶活性高，耐高温。同时通过进一步的改造所获得突变体与野生型比较，大大提高其酶活及其热稳定性，具有更优良的热稳定性与更高的酶活，从而具有更广阔的应用前景。本专利技术通过对该壳聚糖酶进行改造，能够大大提高其酶活及其热稳定性。本专利技术涉及的突变体与野生型比较，具有更优良的热稳定性与更高的酶活，从而具有更广阔的应用前景。本专利技术所具有的优点：本专利技术所述壳聚糖酶活性高，耐高温；同时通过进一步的改造所获得突变体与野生型比较，大大提高其酶活及其热稳定性，具有更优良的热稳定性与更高的酶活，从而具有更广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例提供的所得壳聚糖酶基因DNA琼脂糖凝胶电泳图。图2为本专利技术实施例提供的壳聚糖酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3为本专利技术实施例提供的所得壳聚糖酶BC345最适pH。图4为本专利技术实施例提供的所得壳聚糖酶TLC产物分析图。图5为本专利技术实施例提供的所得壳聚糖酶及其突变体热稳定性图。图6为本专利技术实施例提供的所得壳聚糖酶及其突变体热稳定性图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。实施例1(1)壳聚糖酶基因的获取根据人肠道菌BacteroidesclarusYIT12056菌株基因组DNA(由GenBank:AFBM00000000.1查阅)中的壳聚糖酶BC345的基因序列，对其进行密码子优化和基因合成。壳聚糖酶BC345的基因序列如SEQIDNO:1所示；对原始序列进行优化后的序列由华大青兰生物科技(无锡)有限公司完成，密码子优化后序列如SEQIDNO:2所示，该壳聚糖酶基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示：SEQIDNO:1:ATGAAAACATGGAAAGCAGAAGCCGCCATTATTGCTGTCGGTATGGTTTTGTTGGGAGTGGTAATAAAATGGGGTATAAACGATTTTATAGATAAGGAGCGTATTGTCAGCGTAAAAGGGCTGGCTGAGATGGAAGTCCCCGCCGATAAGGTAATATGGCCTTTGATGTATAAGGATATCGGGAACGACCCGTCTTTGCTTTATGCCAATATGGAGCAGAAGAACAAAGTTATTGTAAAGTTTCTGGAAAGTAACGGCATCGCTAAAGAAGAAATCAGCATTGCTCCGCCCGAAGTGATAGACATGCAGGCCGAACGTTACGGAAACCGTGATATAGCTTATCGGTACAATGCCACATCGGTCATTACGGTCACTTCAAAGAATGTAGACAAGGTGCGGAAGTTGATGTCGGAACAAGCCGAGCTGCTGAAACAGGGTATTGCCATCAGCGGGGGCGATTACCGCTATAACGTGGTATACGAGTTTACGGGCTTGAATGACGTGAAACCGCAAATGATAGAAGAAGCTACGAAGAATGCCCGTGCCGCAGCCGAGAAGTTTGCGAAAGACTCGGACAGCAGTCTGGGTAAGATACGGAATGCTTCGCAGGGACAATTCTCCATTTCGGACAGAGATGCCAATACACCTTATATTAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：壳聚糖酶突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A)，其氨基酸序列如下SEQID NO:4所示；/n或，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345PA)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；/n或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A/PA)其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：壳聚糖酶突变体为壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A)，其氨基酸序列如下SEQIDNO:4所示；
或，所述壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345PA)，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示；
或，壳聚糖酶BC345氨基酸序列第116位点上的络氨酸Y突变成丙氨酸A，且壳聚糖酶BC345突变体氨基酸的末端加上一段富含丙氨酸A，所得突变体(BC345/Y116A/PA)其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。


2.按权利要求1所述的壳聚糖酶突变体，其特征在于：所述壳聚糖酶BC345为人肠道菌B...

【专利技术属性】
技术研发人员：公衍军，石琨，
申请(专利权)人：潍坊麦卡阿吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37