一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共545个氨基酸，理论分子量为65.21kDa。该耐盐六磷酸海藻糖水解酶最适作用pH为7.5，在pH 7.0～8.0范围内处理1h后，酶活剩余90％以上；最适作用温度为30℃，在37℃条件下耐受1h对酶活基本无影响。该酶活性随着NaCl浓度的提高而增强，在NaCl浓度为4M时酶活性达到最大(约35倍)。在0.5‑5M NaCl条件下处理1h和24h后酶活性仍然增强，在5M NaCl条件下处理24h其酶活提高43倍，典型的耐盐酶，具有用做报告基因及在其它盐环境中应用的潜力。

A salt tolerant trehalose hexaphosphate hydrolase and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶及其制备方法和应用。
技术介绍
六磷酸海藻糖水解酶(EC3.2.1.93)能催化水解六磷酸海藻糖生成葡萄糖和六磷酸葡萄糖，并可通过糖酵解途径进一步代谢。海藻糖广泛存在于各种生物中，在应对高温及渗透压力方面起重要作用。当外部环境的渗透压低时，大肠杆菌吸收外源性海藻糖作为碳和能量来源，吸收的海藻糖通过特异性磷酸酶系统(PTS)磷酸化成六磷酸海藻糖(T6P)，而六磷酸海藻糖又可被六磷酸海藻糖水解酶水解。耐盐六磷酸海藻糖水解酶在高盐浓度中具有较高的酶活，在研究耐盐菌株等方面用作报告基因有显著优势。此外，还可从耐盐六磷酸海藻糖水解酶的组成特性获得启发，对用于高盐废水处理及食品加工的生物酶人工修饰改造，提高酶在处理废水及食品加工方面的稳定性及利用率。因此开发适用于盐环境的六磷酸海藻糖水解酶具有重要意义。近年来，报道的六磷酸海藻糖水解酶主要来源于Bacilluslicheniformis(Chuangetal.，2012；Ongetal.，2014；Chenetal.，2015；Linetal.，2016)，Bacillussp.GP16(Karelovetal.，2003)，Lactobacillusacidophilus(Duongetal.，2006)，KlebsiellapneumoniaeStrain(Wuetal.，2011)，Bacillussubtilis(Sniezkoetal.，1998)，Escherichiacoli(RimmeleandBoos，1994)。但只有少数六磷酸海藻糖水解酶基因(RimmeleandBoos，1994；Karelovetal.，2003；Chuangetal.，2012；Ongetal.，2014；Chenetal.，2015)被克隆、表达并鉴定。其中，来源于B.licheniformis(Chuangetal.，2012)的六磷酸海藻糖水解酶(BlTreA)具有较好的耐盐性，酶活在100MMNaCl中增强3.1倍。动物胃肠道内存在大量微生物，它们与动物机体生理功能密切相关，被认为是星球上最为密集的微生物生态系统。这些微生物区系之间及微生物与动物宿主之间形成了相互依存，相互作用的不可分割的整体。栖息于胃肠道的微生物面临着如酸、胆盐、渗透压等压力，研究表明相对高渗的胃肠道腔(相当于0.3Mol/LNaCl)及饮食的变化可导致胃肠道中渗透压力的产生，为适应外部环境压力的改变，微生物的某些基因可能被激活，从而产生适应压力环境的特殊蛋白。目前，利用纯培养技术研究者们已从嗜盐和耐盐微生物中获得了各类耐盐基因，然而所得的耐盐基因数量仍比分离获得的耐盐菌数量要少得多。随着后基因组时代的到来，宏基因组学技术的出现避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，为寻找和发现新的耐盐功能基因提供了新的研究策略。然而，目前对胃肠道微生物宏基因组来源耐盐基因及酶的研究较少。2012年以来，Culligan等从人肠道微生物宏基因组文库中筛选获得耐盐克隆，并相继得到mazG(Culliganetal.，2012)，stlA(Culliganetal.，2013)，sdtR(Culliganetal.，2014a)和brpA(Culliganetal.，2014b)等与耐盐性相关的基因。2018年，Verma等又从人粪便宏基因组文库中筛选获得TMSRP1、ABCTPP、TLSRP1等与其耐盐相关的基因。此外，Ilmbergeretal.(Ilmbergeretal.，2012)从动物胃肠道宏基因组中获得耐盐的水解酶celA84，其在4MNaCl条件下处理34天保留50％的相对酶活。上述耐盐相关基因及酶的发现，证实了胃肠道微生物蕴含着丰富的耐盐基因及酶，并可通过宏基因组学技术进行挖掘。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种动物粪便宏基因组来源的耐盐六磷酸海藻糖水解酶，同时还提供了该水解酶的构建方法，本专利技术耐盐六磷酸海藻糖水解酶具有良好的耐盐特性。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种动物粪便宏基因组来源的耐盐六磷酸海藻糖水解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，共545个氨基酸，理论分子量为65.21kDa。所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶最适作用pH为7.5，在pH7.0～8.0范围内处理1h后，酶活剩余90％以上；最适作用温度为30℃，在37℃条件下耐受1h对酶活无影响；该酶活性随着NaCl浓度的提高而增强，在NaCl浓度为4M时酶活性达到最大(约35倍)；在0.5-5MNaCl条件下处理1h和24h后酶活性仍然增强，在5MNaCl条件下处理24h其酶活甚至提高到43倍。所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶所具有的良好的耐盐特性，具有用做报告基因及在其它盐环境中的应用潜力。所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶在盐环境中降解六磷酸海藻糖的应用也在本专利技术的保护范围之内。在本专利技术的另一方面，提供了所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，基因大小为1638bp。在本专利技术的另一方面提供了包含所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶编码基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体为pEasy-E2-tre_P2。在本专利技术的另一方面，提供了包含所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶编码基因重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/tre_P2。本专利技术通过PCR的方法克隆到六磷酸海藻糖水解酶基因tre_P2，将基因tre_P2与质粒pEasy-E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。在本专利技术的另一方面，提供了所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的制备方法，包括以下步骤：1)从宏基因组文库中筛选耐盐克隆，并提取其fosmid质粒；2)以所述fosmid质粒DNA为模板，以SEQIDNO.3所示的引物tre_P2-F和SEQIDNO.4所示的引物tre_P2-R进行PCR扩增，得到六磷酸海藻糖水解酶基因；3)将六磷酸海藻糖水解酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌株，诱导重组六磷酸海藻糖水解酶表达；4)回收并纯化所表达的六磷酸海藻糖水解酶，得到六磷酸海藻糖水解酶。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的最适pH为7.5；经pH7.0～8.0的缓冲液处理1h后，酶活剩余90％以上；最适温度为30℃；在37℃条件下耐受1h，其仍保持100％酶活；45℃条件下耐受30min，酶活损失至约30％；在pH7.5，温度30℃，100mMNaCl条件下，该酶的Km、和Kcat分别为15.63mM和10.04s-1；GuHCl，KCl，NaCl，EDTA，β-巯基乙醇，DTT，EGTA，MgCl2和MnSO4对六磷酸海藻糖水解酶有增强作用，PbCl2，CTAB，Ag本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种耐盐六磷酸海藻糖水解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.权利要求1所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。


4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。


5.权利要求1所述的耐盐六磷酸海藻糖水解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将六磷酸海藻糖水解酶基因的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌株，诱导重组六磷酸海藻糖水解酶表达；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：许波，杨雁霞，黄遵锡，吴倩，杨云娟，李俊俊，唐湘华，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53