具有优越的温度稳定性与pH耐受性的木聚糖酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了具有优越的温度稳定性和pH耐受性的木聚糖酶及其应用，该木聚糖酶具有优越的温度稳定性和pH耐受性。在pH6.5缓冲体系，35℃到65℃之间，此酶均可以保持活性9个小时以上不降低。在4℃，pH4.0‑10.0缓冲液中均可以保持活性12个小时以上不降低，该酶可从厌氧嗜热细菌中获得，适用于不同温度，pH条件下木聚糖的分解。可用于丙酮丁醇梭菌37℃发酵产丁醇过程中，扩大底物广泛性，加强对木聚糖的利用，降低生产成本。

Xylanase with superior temperature stability and pH tolerance and its application

【技术实现步骤摘要】
具有优越的温度稳定性与pH耐受性的木聚糖酶及其应用
本专利技术属于生物
,具体涉及一种具有优越的温度稳定性与pH耐受性的木聚糖酶。
技术介绍
木聚糖是自然界中的一种丰富的再生资源，是最具代表性的半纤维素，占半纤维素的1/3～1/2，是除纤维素外，自然界中最丰富的多糖。与纤维素相比，半纤维素更易被微生物降解转化。木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，通过水解木糖分子β-1，4-糖苷键，将木聚糖水解为木寡糖和木二糖等低木聚糖，及少量木糖和阿拉伯糖。用木聚糖酶处理玉米芯可以降解木聚糖，为以木糖为碳源的微生物提供能量。由于木聚糖酶可以用于纸浆的预漂白、饲料添加剂提高饲料的能量值及畜禽对饲料的吸收率、增殖肠道内的双歧杆菌，用于食品改良剂和酿酒等方面，所以作为一种工业用酶制剂，木聚糖酶具广泛的应用价值。在生物丁醇的生产中，梭菌以木糖为底物，为了降低生产成本和加强对木聚糖的利用，我们需要也需要具有优越温度稳定性，pH耐受性的木聚糖酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有优越的温度稳定性，pH耐受性的木聚糖酶及其应用。为了实现上述目的，本专利技术从一株嗜热厌氧菌中分离纯化出一种木聚糖酶。一种具有优越温度稳定性与pH耐受性的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的木聚糖酶的编码基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。所述的木聚糖酶在35℃到65℃之间均可以保持活性9个小时以上不降低，具有优越的温度稳定性，在pH4.0-10.0缓冲液中均可以保持活性12个小时以上不降低，具有优越的pH耐受性。该酶来自于菌株ThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticmM5。一种表达载体，它包含所述的木聚糖酶基因。一种重组菌，其是通过利用所述的表达载体转化宿主细胞获得的。该木聚糖酶在pH6.5,35℃到65℃之间至少可以保持活性9小时不降低；在4℃，pH4.0-10.0缓冲液中均可以保持活性12个小时以上不降低。所述木聚糖酶在降解木聚糖中的应用。所述的木聚糖酶在生产生物丁醇、酿造、饲料、造纸、食品纺织等应用工业中的应用。所述含有木聚糖酶编码基因的表达载体和表达体系。有益效果：本专利技术所提供的木聚糖酶性质优良，适合生物丁醇，酿造，饲料，造纸，食品纺织等应用工业。本专利技术的木聚糖酶具有优越的温度稳定性，pH耐受性。在pH6.5缓冲体系，35℃到65℃之间此酶均可以保持活性9个小时以上不降低。在4℃，pH4.0-10.0缓冲液中均可以保持活性12个小时以上不降低。附图说明图1为木聚糖酶的SDS-PAGE电泳图；图2为木聚糖酶活性随温度的变化；图3为木聚糖酶活性随pH的变化；图4为木聚糖酶活性热稳定性变化图；图5为木聚糖酶活性pH耐受性变化图。本专利要求2019年5月20日提交的申请号为：201910417176X的优先权。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、木聚糖酶的制备和纯化该木聚糖酶来源于菌株ThermoanaerobacteriumthermosaccharolyticmM5,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年2月27日，保藏号为CCTCCNO:M2017072.通过菌落pcr得到该菌中木聚糖酶序列，将其去除终止子后连入pET29a（+）或pET28a(+)中，并将连接后的质粒导入大肠杆菌DH5α中，随后将验证正确的质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中。以备后续木聚糖酶的诱导表达纯化。LB培养基组成：酵母提取物(yeastextract)5g/L，NaCl5g/L，蛋白胨(peptone)10g/L。在37℃下摇菌至OD600为0.6-0.8后，加入终浓度0.5mM的IPTG，16-37℃下诱导16-24小时，记摇瓶中的所有液体为发酵液，将发酵液6000rpm，10min，4℃离心收集菌体，将得到的含有目的蛋白的菌体，用磷酸盐缓冲液(0.05mMpH6.5PBS)悬浮离心重复两次，第三次加入20ml重悬菌泥，使各菌体细胞充分悬浮后采用超声波法破碎细胞。所得细胞破碎液经4℃、8000rpm、离心10min，所得的上清经0.22μm滤膜过滤后即为菌体的粗酶液。进行蛋白纯化，具体方法为：Ni-NTA-Sefinose柱中的乙醇流出后，加入5倍柱体积的无菌水，磷酸盐缓冲液(50mMpH6.5PBS)，平衡层析柱。加入粗酶液，然后依次加入咪唑浓度逐渐升高的洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl)，咪唑浓度分别为50mM、100mM、200mM、250mM，350mM，pH8.0)洗脱，并分段收集洗脱液。将木聚糖酶200mM和250mM咪唑的洗脱液分别使用10kDa超滤管置换PBS缓冲液(PBS缓冲液，50mM，pH6.5)，以去除酶液中的咪唑，从而获得木聚糖酶酶液。将上述纯化得到的蛋白质溶液进行SDS-PAGE电泳，纯化结果如图1所示，1为纯化后的酶液，2为粗酶液，所获得的木聚糖酶分子量为47.7kDa。实施例2、酶学特性检测将上述方法获得的木聚糖酶进行下述反应进行酶学特性鉴定：1、木聚糖酶的酶活的测定利用上述纯化的木聚糖酶，进行下述反应：将上述获得的浓度为0.646μg/ml的木聚糖酶溶液稀释5倍取100μl，分别加入到100μl1％的木聚糖溶液中，其中木聚糖溶于磷酸盐缓冲液(50mMpH6.5PBS)，在55℃下反应10分钟。使用3.5-二硝基水杨酸(DNS)法测定反应结束后还原糖的生成量。上述反应结束后加入200μlDNS溶液，煮沸5分钟，冷却后加入2.1ml水并混匀，用分光光度计，测其在540nm的吸收值。一个酶活单位定义为每分钟水解底物产生1μmol还原糖所需的酶量。比酶活力定义为酶活与对应蛋白量的比值。酶活反应体系如表1所示。表1酶活反应体系组分空白实验对照组样品组样品对照组缓冲液200μl100μl100μl底物100μl100μl酶液100μl100μl2、木聚糖酶的最适反应温度、最适反应pH的测定将实施例1纯化的木聚糖酶在不同pH范围(pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0为50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液；pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0为PBS缓冲液；pH8.0、8.5、9.0、9.5、10.0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)中进行酶促反应，测定其最适反应p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有优越的温度稳定性和pH耐受性的木聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。/n

【技术特征摘要】
20190520 CN 201910417176X1.一种具有优越的温度稳定性和pH耐受性的木聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.编码权利要求1所述的木聚糖酶的基因，其DNA序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1所述的木聚糖酶，其特征在于，该酶35℃到65℃之间均可以保持活性9个小时以上不降低，具有优越的温度稳定性，在pH4.0-10.0缓冲液中均可以保持活性12个小时以上不降低，具有优越的pH耐受性。


4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：信丰学，吕阳，姜岷，蒋羽佳，董维亮，章文明，方艳，马江锋，周杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32