一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法。本发明专利技术公开了一种细胞分离培养液。本发明专利技术中，培养液A、培养液B和培养液C，三种培养液协同配合，共同作用，有利于刺激单核细胞向CIK细胞进行转化。通过向血细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量。使用中性粒细胞分离液提取单个核细胞后，使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细胞，明显减少单个核细胞中的红细胞含量，提高淋巴细胞数量。最终培养后细胞中有效细胞比例增加，增加细胞群的杀瘤活性。

A method of cell culture medium and T cell culture

【技术实现步骤摘要】
一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法。
技术介绍
T细胞，是由来源于骨髓的淋巴干细胞，在胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。过继性免疫细胞治疗是指从人体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向人体回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性T细胞治疗主要包括TIL、LAK、CIK、TCR-T、CAR-T等几大类。目前体外培养T细胞通常包括以下4个步骤：分离单个核细胞、激活诱导、扩增、收集。目前分离单个核细胞通常是使用Ficoll实现，常规的T细胞培养方法是将分离的单个核细胞用因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的T细胞。在使用Ficoll提取单个核细胞进行T细胞的培养时，由于部分血液供体机体状态原因，分离出的单个核细胞中还夹杂着大量红细胞。若直接进行培养，不仅在培养周期中难以观察T细胞的生长情况，且影响T细胞的培养环境，并影响后续对T细胞性能的检测和T细胞性能。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种细胞分离培养液和T细胞分离培养的方法，该细胞分离培养液使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细胞，明显减少单个核细胞中的红细胞含量，提高T细胞数量，提高检测的准确性，最终培养后T细胞中有效细胞比例增加，增加细胞群的杀瘤活性。其具体技术方案如下：本专利技术提供了一种细胞分离培养液，包括：中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、培养液A、培养液B和培养液C；所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；所述培养液C为：IL-2和基础培养基。本专利技术中，通过向血细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量。使用中性粒细胞分离液提取单个核细胞后，使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细胞，明显减少单个核细胞中的红细胞含量，提高淋巴细胞数量。最终培养后细胞中有效细胞比例增加，增加细胞群的杀瘤活性。本专利技术细胞分离液中的细胞优选为T细胞。本专利技术将培养液B中IL-2、IL-1α和CD3单克隆抗体进行复配，结合培养液A和培养液C共同作用，有利于刺激单核细胞向CIK细胞进行转化。本专利技术所述细胞优选为CIK细胞。本专利技术中，所述培养液A中IFN-γ的终浓度为2500～5000IU/ml，更优选为5000IU/ml；所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体的终浓度分别为500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml，更优选分别为1000IU/ml、5ng/ml、500ng/ml；所述培养液C中的IL-2终浓度为500～1000IU/ml，更优选为1000IU/ml。本专利技术中，细胞培养液还包括自体血浆。将自体血浆作为营养物质，避免了胎牛血清的使用，减少外源致热源，致敏污染，且降低了培养成本。本专利技术基础培养基优选为淋巴细胞无血清培养基。本专利技术还提供了一种T细胞的培养试剂盒，包括上述细胞分离培养液。本专利技术还提供了一种T细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤1：向外周血或全血中分离单个核细胞；步骤2：向所述单个核细胞中加入红细胞裂解液裂解红细胞，得到纯化的单个核细胞；步骤3：第0天，将所述纯化的单个核细胞接种于培养液A中进行培养；步骤4：培养至第1天，加入培养液B进行培养；步骤5：培养至第4、8、11天，分别加入培养液C进行培养，继续培养至第14天，得到T细胞；所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；所述培养液C为：IL-2和基础培养基。本专利技术培养液A和培养液B均为T细胞刺激培养液，培养液C为T细胞扩增培养液。本专利技术步骤3中，所述纯化的单个核细胞的接种量为1×106～2×107,个/ml，优选为2×106～4×106个/ml。本专利技术提供的分离培养方法中，对含有不同细胞因子的培养液在不同时间段加入，共同作用刺激T细胞的高效转化。本专利技术提供的分离培养方法中，培养液A、培养液B和培养液C中各细胞因子的浓度与上述细胞分离培养液中的各细胞因子的浓度相同，此处不再赘述。本专利技术步骤1具体为：对所述全血或外周血进行第一离心，得到血细胞悬液，然后加入中性粒细胞分离液进行第二离心，分层后，吸取单个核细胞层，得到单个核细胞；所述第一离心的速率为2000rpm-2500rpm，时间为10min-15min，优选为2500rpm离心10min；进行第一离心后，取上层自体血浆保留。所述第二离心的速率为500g-550g，时间为20min-30min，优选为550g离心30min。所述中性粒细胞分离液与所述血细胞悬液的体积比为2：1；所述得到血细胞后，加入中性粒细胞分离液之前，还包括：按血细胞悬液体积比为1：1加入生理盐水稀释，得到血细胞稀释液。所述吸取单个核细胞之后，还包括：第三离心；所述第三离心的速率为250g-300g，时间为5min-10min，优选为250g离心10min。本专利技术步骤2具体为：将步骤1所述单个核细胞中加入红细胞裂解液裂解红细胞，得到纯化的单个核细胞。所述单个核细胞与所述红细胞裂解液的的体积比为(1：5)～(1：8)，优选为1：8。本专利技术中，加入所述红细胞裂解液的体积不低于2mL。所述加入红细胞裂解液之后，还包括：进行第四离心，弃上清，加生理盐水重悬，进行第五离心，弃上清，得到纯化的单个核细胞。所述第四离心的速率为，时间为，优选为10min；所述第五离心的速率为，时间为，优选为5min。本专利技术步骤3具体为：第0天，第0天，使用培养液A重悬所述单个核细胞，转移至培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。本专利技术步骤4中，培养至第1天，加入培养液B，并补充自体血浆，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养72h。本专利技术步骤5具体为：培养至第4、8、11天，加入培养液C进行培养，细胞浓度超过1×107个/ml时转移至更大的培养容器中，并补充自体血浆。从以上技术方案可以看出，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种细胞分离培养液，包括：中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、培养液A、培养液B和培养液C；培养液A为：IFN-γ和基础培养基；培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；培养液C为：IL-2和基础培养基。本专利技术中，培养液A、培养液B和培养液C，三种培养液协同配合，共同作用，有利于刺激单核细胞向T细胞进行转化。通过向血细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量。使用中性粒细胞分离液提取单个核细胞后，使用红细胞裂解液去除单个核细胞层中大部分红细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞分离培养液，其特征在于，包括：中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、培养液A、培养液B和培养液C；/n所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；/n所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；/n所述培养液C为：IL-2和基础培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞分离培养液，其特征在于，包括：中性粒细胞分离液、红细胞裂解液、培养液A、培养液B和培养液C；
所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；
所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；
所述培养液C为：IL-2和基础培养基。


2.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，所述培养液A中IFN-γ的浓度为2500～5000IU/ml；
所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体的浓度分别为500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml；
所述培养液C中的IL-2浓度为500～1000IU/ml。


3.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，还包括：自体血浆。


4.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，所述基础培养基为淋巴细胞无血清培养基。


5.一种T细胞培养试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任意一项所述的细胞分离培养液。


6.一种T细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：向外周血或全血中分离单个核细胞；

【专利技术属性】
技术研发人员：马玉国，
申请(专利权)人：广州航华生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44