一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺制造技术

本发明专利技术提供一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，所述的制备高效扩增工艺包括了采集脐血、添加试剂盒因子、离心、打匀、培养、转袋、增殖、收集冻存等工序。本发明专利技术在扩增NK细胞之前对脐血进行多项指标进行检测，确保脐血符合要求，在NK细胞扩增后进行二次检测，增强NK细胞的产品质量，整个高效扩增工艺操作简便，劳动强度小，制备成本低、扩增工艺易于掌握、制备效率高、制备数量大的优点。

An efficient amplification technique for NK cells from cord blood

【技术实现步骤摘要】
一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺
本专利技术涉及NK细胞扩增
，具体是一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺。
技术介绍
NK细胞又称自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞，这种天然杀伤活性无需抗原致敏，并且无MHC限制性。它能自己识别和攻击外来病毒、癌细胞和异常细胞，一旦被激活，通过释放颗粒酶和穿孔素等杀伤性介质及分泌大量细胞因子直接攻击靶细胞，或通过抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，或通过诱导Fas/Fasl和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Trail)分子使靶细胞凋亡。目前NK细胞的来源主要是靠自体和异源供给，自体NK细胞作用有限，在能够表达HLA的癌细胞面前无法发挥杀伤作用，而且人体自身NK细胞数量有限，NK细胞处于不同的发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型及功能均存在很大的差异。以往的异源NK细胞主要是来源于外周血、骨髓、胚胎和胎盘，不仅难收集供者，且由于分离其他免疫细胞的成本极高，这些都限制了NK细胞在临床中上大规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的操作工艺包括以下步骤：/n一、超净台/生物安全柜提前开紫外消毒30min,并提前开空调机组30min；/n二、工作人员消毒灭菌后入洁净区；/n三、采70ml脐血，将其放至标本传递窗，检查是否有母体完整的病毒检测体检报告，若没有病毒体检报告，则要需要送脐血血浆到质检中心作以上的病毒检测，核对血袋上相应的信息和采集表上信息是否一致，并观察包装情况、血样有没有异常情况，经核对合格后可进行下一步操作；/n四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培养瓶中，再加入相应试剂盒因子，用移液管吸取T175培养瓶中的D-PBS洗试剂盒2-...

【技术特征摘要】
1.一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的操作工艺包括以下步骤：
一、超净台/生物安全柜提前开紫外消毒30min,并提前开空调机组30min；
二、工作人员消毒灭菌后入洁净区；
三、采70ml脐血，将其放至标本传递窗，检查是否有母体完整的病毒检测体检报告，若没有病毒体检报告，则要需要送脐血血浆到质检中心作以上的病毒检测，核对血袋上相应的信息和采集表上信息是否一致，并观察包装情况、血样有没有异常情况，经核对合格后可进行下一步操作；
四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培养瓶中，再加入相应试剂盒因子，用移液管吸取T175培养瓶中的D-PBS洗试剂盒2-3次，用封口膜封口，37℃培养箱内包被2h；
五、用2支50ml离心管离心全血，800g×15min离心，用10ml移液管收集脐血血浆，其余血浆56℃水浴灭活30min，放置-20℃10min后再次离心处理，1100g×15min离心，取上清血浆做好标记待用；
六、取步骤五中离心后下部细胞部分，加入D-PBS至50ml打匀；
七、准备两支50ml的高效离心管，各加入12.5ml人淋巴细胞分离液，200g×2min离心，使分离液完全处于隔膜下方且没有气泡，将打匀的细胞缓慢均匀的加入到2个50ml离心管中，800g×15min离心；
八、取分离后的白膜细胞层（新手离心后隔板上的细胞都是所需细胞,待熟练后可舍弃部分细胞），加入到50ml离心管中，加入未加因子的培养基至50ml，吹打均匀，600g×10min离心；
九、步骤八中上部分离出的PBMC用未加任何因子的NK-EX培养基混匀成细胞悬液40ml，细胞悬液中加入相应试剂盒因子，取出包被好的T175瓶，用吸管吸出其中的包被液体，吸的过程中不要碰包被面，加入10ml血浆，加入40ml细胞悬液，用酒精棉球擦拭瓶口和封口膜并用封口膜封口，置于37℃，5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养；
十、NK培养液配制方法：增殖培养基为每瓶1000mlNK-EX培养基加入相应试剂盒因子；活化培养基为每500ml增殖培养基中加入本试剂盒一支相应试剂盒因子；先使用活化培养基，再使用增殖培养基；
十一、第4天：加入40ml活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十二、第6天：加入70mlNK活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十三、第8天转袋：NK细胞在T175培养瓶中培养一段时间，细胞数达到一定数量便要将细胞转入到一个培养袋中继续进行培养；
（1）从培养箱中拿出培养NK细胞的T175瓶标记为，显微镜下观察细胞状态和数量，观察过之后将其放在超净工作台内操作，用酒精棉球擦拭瓶口，并将其中的培养液倒入备好的T175培养瓶中标记为，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：张扬，李陶，高力扬，张立忠，周晓宇，
申请(专利权)人：中科宝承生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64