一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法。本发明专利技术公开了一种细胞分离培养液，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；培养液A为：IFN‑γ和基础培养基；培养液B为：IL‑2、IL‑1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；培养液C为：IL‑2和基础培养基。本发明专利技术细胞分离培养液的中性粒细胞分离液可以除去细胞中中性粒细胞，从而使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。

A purification, isolation and culture method for improving the killing activity of immune cells

【技术实现步骤摘要】
一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法。
技术介绍
目前，CIK细胞培养大多从外周血通过Ficoll提取，并在多种细胞因子组合刺激，获得一定数量及活性的CIK细胞。但传统的方法分离提取得到的CIK细胞有效细胞比例较少，体外杀瘤活性不理想。
技术实现思路
本专利技术提供了一种提高免疫细胞杀伤活性的纯化分离培养方法，解决了现有的CIK细胞有效细胞比例较少，体外杀瘤活性不理想的问题。其具体技术方案如下：本专利技术提供了一种细胞分离培养液，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；所述培养液C为：IL-2和基础培养基。中性粒细胞占白细胞的50～70％，是外周血循环和免疫系统中含量最丰富的白细胞。各类白细胞百分比为：嗜中性粒细胞50～70％，嗜酸性粒细胞0.5～5％，嗜碱性粒细胞0～1％，淋巴细胞20～40％，单核细胞3～8％。中性粒细胞活化的标志物为CD11b和CD66b，不表达CD3、CD56、CD8膜蛋白分子。本专利技术中，通过向细胞中加入中性粒细胞分离液，从而减少细胞中中性粒细胞的含量，使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。本专利技术将培养液B中IL-2、IL-1α和CD3单克隆抗体进行复配，结合培养液A和培养液C共同作用，有利于刺激单核细胞向CIK细胞进行转化。本专利技术所述细胞优选为CIK细胞。本专利技术中，所述培养液A中IFN-γ的终浓度为2500～5000IU/ml，更优选为5000IU/ml；所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体的终浓度分别为500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml，更优选分别为1000IU/ml、5ng/ml、500ng/ml；所述培养液C中的IL-2终浓度为500～1000IU/ml，更优选为1000IU/ml。本专利技术中，细胞培养液还包括自体血浆。将自体血浆作为营养物质，避免了胎牛血清的使用，减少外源致热源，致敏污染，且降低了培养成本。本专利技术基础培养基优选为淋巴细胞无血清培养基。本专利技术还提供了一种CIK细胞分离培养试剂盒，包括上述细胞分离培养液。本专利技术还提供了一种CIK细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤1：向外周血中分离单个核细胞；步骤2：第0天，将单个核细胞接种于培养液A中进行培养；步骤3：培养至第1天，加入培养液B进行培养；步骤4：培养至第4、8和11天，分别加入培养液C进行培养，继续培养至14天，得到CIK细胞；所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；所述培养液C为：IL-2和基础培养基。本专利技术培养液A和培养液B均为CIK细胞刺激培养基，培养液C为CIK细胞扩增培养基。本专利技术步骤2中，所述单个核细胞的接种量为1×106～2×107个/ml，优选为2×106～4×106个/ml。本专利技术提供的分离培养方法中，对含有不同细胞因子的培养液在不同时间段加入，共同作用刺激CIK细胞的高效转化。本专利技术步骤1具体为：取人体外周静脉血，加入中性粒细胞分离液进行第一离心，分层后吸取单个核细胞层，得到单个核细胞。所述第一离心的速率为1500rpm-1800rpm，时间为20min-30min，优选为1700rpm离心30min。所述吸取单个核细胞层之后，得到所述单个核细胞之前，还包括：向吸取的单个核细胞层加入生理盐水进行第二离心，重复两次；所述第二离心的速率为1000rpm-1500rpm，时间为5min-10min，优选为1000rpm离心10min。本专利技术步骤2具体为：第0天，使用培养液A重悬所述单个核细胞，优选转移至T75m2培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。本专利技术步骤4具体为：培养至第4天，将培养瓶中的全部细胞转移至新的T75m2培养瓶中，再加入培养液C继续培养；培养至第8天，将所述T75m2培养瓶中的全部细胞转移至新的T125m2培养瓶中，再加入培养液C继续培养；培养至11天，补充培养液C继续培养至第14天，得到CIK细胞。本专利技术加入所述培养液B或所述培养液C时，均需加入血浆，优选加入1ml的自体血浆。本专利技术提供的分离培养方法中，培养液A、培养液B和培养液C中各细胞因子的浓度与上述细胞分离培养液中的各细胞因子的浓度相同，此处不再赘述。本专利技术CIK细胞的分离培养中，优选还可以加入中性粒细胞分离液除去中性粒细胞，使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。本专利技术中性粒细胞分离液的加入方式有三种：第一种：在步骤1外周血提取单个核细胞时加入，具体为：向所述外周血中加入中性粒细胞分离液，分层后，吸取单个核细胞层。第二种：在步骤4培养至第8天时加入，具体为：将培养至第8天的样品加入中性粒细胞分离液，离心后，吸取单个核细胞层加入所述培养液C进行培养。第三种：在步骤4培养至第14天加入，具体为：将培养至第14天的样品加入中性粒细胞分离液，离心后，取单个核细胞层，即为CIK细胞。本专利技术优选采用第一种或第三种方法加入中性粒细胞分离液。第一种和第三种方法较第二种方法加入中性粒细胞分离液分离培养得到的CIK细胞的有效细胞比例高，杀伤活力高。上述三种方法中，中性粒细胞分离液与待分离液的体积比为1：1；第二种和第三种中性粒细胞的加入方法中，取单个核细胞层后均优选采用生理盐水进行洗涤2～3次，优选洗涤2次。从以上技术方案可以看出，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种细胞分离培养液，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；培养液A为：IFN-γ和基础培养基；培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；培养液C为：IL-2和基础培养基。本专利技术细胞分离培养液采用特定的培养液：培养液A、培养液B和培养液C，三种培养液协同配合，共同作用，有利于刺激单个核细胞向CIK细胞进行转化。另外，本专利技术细胞分离培养液中的中性粒细胞分离液可以除去细胞中中性粒细胞，从而使得培养得到的有效细胞比例增加，进而增加细胞群的杀伤活性。由实验数据可知，本专利技术提供细胞分离培养液培养的CIK细胞在效靶比为20：1时，细胞的杀伤活力为70％以上，效靶比为10：1时，细胞的杀伤活力最高可达到约80％。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。...

【技术保护点】
1.一种细胞分离培养液，其特征在于，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；/n所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；/n所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；/n所述培养液C为：IL-2和基础培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞分离培养液，其特征在于，由中性粒细胞分离液、培养液A、培养液B和培养液C组成；
所述培养液A为：IFN-γ和基础培养基；
所述培养液B为：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；
所述培养液C为：IL-2和基础培养基。


2.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，所述培养液A中IFN-γ的浓度为2500～5000IU/ml；
所述培养液B中的IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体的浓度分别为500～1000IU/ml、2.5～5ng/ml、250～500ng/ml；
所述培养液C中的IL-2浓度为500～1000IU/ml。


3.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，所述基础培养基为淋巴细胞无血清培养基。


4.根据权利要求1所述的细胞分离培养液，其特征在于，还包括：自体血浆。


5.一种CIK细胞分离培养试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任意一种所述的细胞分离培养液。


6.一种CIK细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：向外周血中分离单个核细胞；
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【专利技术属性】
技术研发人员：马玉国，林俊雯，孙营，
申请(专利权)人：广州航华生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44