一种NK细胞培养液及培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种NK细胞培养液及培养方法。本发明专利技术公开了一种NK细胞培养液，该培养液将IFN‑γ和IL‑15进复配，将IL‑2、IL‑1α、CD3单克隆抗体进行复配，共同作用有利于刺激外周血单个核细胞向NK细胞高效转化，增加了NK细胞的倍率，获得了更多的NK细胞，且CD3‑CD56+和CD3+CD56+含量高，杀伤活性高，说明本发明专利技术提供的NK细胞培养液在增加了NK细胞扩增数量的同时显著提高细胞毒活性。

A kind of NK cell culture medium and method

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞培养液及培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种NK细胞培养液及培养方法。
技术介绍
NK细胞是参与机体抵抗肿瘤和抗病毒感染以及免疫调节的重要免疫细胞，其在杀伤靶细胞的过程中无MHC限制性，不依赖抗体，通过直接和间接途径有效杀伤多种肿瘤细胞。但正常人体外周血中NK细胞数量较少，仅占外周血单个核细胞总数的10％～20％。近年来，细胞免疫治疗获得了突破性进展，NK细胞治疗也取得了一定的临床疗效。目前，如何获得大量高质量高纯度的NK细胞是其临床应用最为关键的问题之一。目前常用的NK细胞体外扩增方法使用的培养液除了添加细胞因子刺激外，还有一种方法是采用滋养层细胞扩增NK细胞，需添加灭活的K562肿瘤细胞株与外周血单个核细胞混合培养以诱导扩增NK细胞。但由于培养液中添加了肿瘤细胞，后期无法进行质量控制，引入安全隐患，难以应用到临床治疗上，且存在难以克服的伦理障碍。
技术实现思路
本专利技术提供了一种NK细胞培养液及培养方法，解决了现有的采用滋养层细胞扩增NK细胞过程中，需添加灭活的K562肿瘤细胞株与外周血单个核细胞混合培养以诱导扩增NK细胞，使得后期无法进行质量控制，引入安全隐患的问题。本专利技术提供了一种NK细胞培养液，包括：培养液A和培养液B；所述培养液A包括：IFN-γ、IL-15和基础培养基；所述培养液B包括：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基。本专利技术中，IFN-γ为干扰素γ；IL-15为白细胞介素15；IL-2为白细胞介素2；IL-1α为白细胞介素1α。IL-15不仅在空间结构上与IL-2类似，而且IL-15R和IL-2R共有βc和γc亚单位，能够促进造血祖细胞分化为CD56+NK细胞。IL-15能够增强NK细胞释放IFN-γ。IL-15能够上调NKG2D活化受体的表达,增强细胞毒作用分子如TRAIL和穿孔素的表达,从而增强NK细胞的裂解活性。IL-2主要由T细胞分泌，通过自分泌和旁分泌的方式促进T细胞、NK细胞、B细胞、外周血单个核细胞增殖分化和效应功能。IL-2同样能够诱导KIR-的NK细胞亚群表达KIR受体，诱导C凝集素受体NKG2D和自然杀伤毒性受体NKp44表达，增强NK细胞释放IFN-γ。IFN-γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。本专利技术将IFN-γ和IL-15进复配，将IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体进行复配，共同作用有利于刺激外周血单个核细胞向NK细胞进行转化。本专利技术中，NK细胞培养液还包括：培养液C；所述培养液C包括：IL-2、IL-15和基础培养基。本专利技术NK细胞培养液还包括：PD-1。本专利技术中，是一种结合于程序性死亡受体-1(PD-1)的单克隆抗体，通过阻断PD-1及其配体PD-L1和PD-L2间相互作用，从而阻断PD-1通路介导的免疫抑制反应，包括抗肿瘤免疫反应。本专利技术在NK细胞培养第13天加入，本专利技术中，PD-1的终浓度为0.5～1.25μg/ml，优选为1～1.25μg/ml，更优选为1.25μg/ml。本专利技术将培养液IL-2、IL-15进行复配进一步刺激外周血单个核细胞诱导向NK细胞转化。本专利技术中，所述IFN-γ在所述培养液A中的终浓度为2500～5000IU/ml，更优选为4000～5000IU/ml，进一步优选为5000IU/ml；所述IL-15在所述培养液A中的终浓度为10～100μg/ml，更优选为20～50μg/ml，进一步优选为50μg/ml；所述IL-2在所述培养液B中的终浓度为IL-2：500～1000IU/ml，更优选为900～1000IU/ml，进一步优选为1000IU/ml；所述IL-1α在所述培养液B中的终浓度为2.5～5ng/ml，更优选为4～5ng/ml，进一步优选为5ng/ml；所述CD3单克隆抗体在所述培养液B中的终浓度为250～500ng/ml，更优选为400～500ng/ml，进一步优选为500ng/ml。本专利技术中，NK细胞培养液还包括：培养液C或培养液D，优选为培养液D。本专利技术中，所述培养液C包括：IL-2、IL-15和基础培养基。所述IL-2在所述培养液C中的终浓度为500～1000IU/ml，更优选为，进一步优选为1000IU/ml。所述IL-15在所述培养液C中的终浓度为10～100μg/ml，更优选为20～50μg/ml，进一步优选为50μg/ml。所述培养液D包括：IL-2和基础培养基。所述IL-2在所述培养液D中的终浓度为500～1000IU/ml，优选为1000IU/ml。本专利技术在培养NK细胞的过程中，依次采用培养液A和培养液B，以及培养液C或培养液D刺激外周血单个核细胞向NK细胞转化，可以得到较高的NK细胞数量和细胞毒活性。本专利技术中，培养液A、培养液B、培养液C和培养液D中的基础培养基均为淋巴细胞无血清培养基；所述血浆为自体血浆。将自体血浆作为营养物质，避免了胎牛血清的使用，减少外源致热源，致敏污染，且降低了培养成本。本专利技术还提供了一种NK细胞培养试剂盒，包上述培养液A、培养液B和PD-1，以及培养液C或培养液D；所述培养液B包括：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；所述培养液C包括：IL-2、IL-15和基础培养基；所述培养液D包括：IL-2和基础培养基。本专利技术NK细胞培养试剂盒中培养液A、培养液B、培养液C和培养液D中各组分的终浓度在上述技术方案中已做具体说明，此处不在赘述。本专利技术还提供了一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤1：第0天，将外周血单个细胞接种于培养液A中进行培养；步骤2：培养至第1天，加入培养液B继续培养；步骤3：培养至2、4、8、11天分别加入培养液C或培养液D继续培养；步骤4：培养至第13天或14天加入PD-1继续培养，培养至15天得到NK细胞；所述培养液B包括：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基；所述培养液C包括：IL-2、IL-15和基础培养基；所述培养液D包括：IL-2和基础培养基。本专利技术步骤1中，外周血单个细胞接种量为2×106～1×107个/ml，优选为2×106～4×106个/ml。本专利技术步骤3中，优选在培养至第2、4、8、11天加入培养液D继续培养。本专利技术步骤4优选在第13天加入PD-1，可以诱导NK细胞抗体特异的细胞毒性。本专利技术中，采用NK细胞培养液及PD-1培养得到的细胞为PD-NK细胞。本专利技术中，步骤1之前，还包括：外周血单个核细胞的分离。本专利技术中，所述外周血单个核细胞的分离包括以下步骤：步骤a：取人体外周血进行离心，将离心得到的红细胞进行稀释，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NK细胞培养液，其特征在于，包括：培养液A和培养液B和；/n所述培养液A包括：IFN-γ、IL-15和基础培养基；/n所述培养液B包括：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞培养液，其特征在于，包括：培养液A和培养液B和；
所述培养液A包括：IFN-γ、IL-15和基础培养基；
所述培养液B包括：IL-2、IL-1α、CD3单克隆抗体和基础培养基。


2.根据权利要求1所述的NK细胞培养液，其特征在于，所述IFN-γ在所述培养液A中的终浓度为2500～5000IU/ml；
所述IL-15在所述培养液A中的终浓度为10～100μg/ml；
所述IL-2在所述培养液B中的终浓度为500～1000IU/ml；
所述IL-1α在所述培养液B中的终浓度为2.5～5ng/ml；
所述CD3单克隆抗体在所述培养液B中的终浓度为250～500ng/ml。


3.根据权利要求1所述的NK细胞培养液，其特征在于，还包括：培养液C或培养液D；
所述培养液C包括：IL-2、IL-15和基础培养基；
所述培养液D包括：IL-2和基础培养基。


4.根据权利要求3所述的NK细胞培养液，其特征在于，所述IL-2在所述培养液C中的终浓度为500～1000IU/ml；
所述IL-15在所述培养液C中的终浓度为10～100μg/ml；
所述IL-2在所述培养液D中的终浓度为500～1000IU/ml。


5.根据权利要求1至4任意一项所述的NK细胞培养液，其特征在于，还包括：自体血浆；
所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马玉国，
申请(专利权)人：广州航华生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44