一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法技术

本发明专利技术公开了一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，涉及医学检测技术领域。该方法通过对羧基化乳胶微球进行预处理、对羧基化乳胶微球进行活化形成活化中间体，最后再与抗体偶联的过程，有效地提高羧基乳胶微球单分散性、乳胶微球活化中间体的浓度以及羧基乳胶微球与抗体的偶联效率，避免乳胶微球发生自凝，维持乳胶微球的活化状态从而提高微球与抗体的有效结合率。

A coupling method of carboxyl latex microspheres and antibodies

【技术实现步骤摘要】
一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法
本专利技术涉及医学检测
，尤其涉及一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法。
技术介绍
免疫层析技术从20世纪90年代发展至今，已成为临床医学常用的、成熟的快速检测技术，其中较为常见的形式是免疫层析试纸条技术。试纸条一般由PVC背板、吸水纸、固相硝酸纤维素膜(NC膜)、结合垫和样品垫组装而成。其工作原理通常是采用直接竞争法、间接竞争法或双抗体夹心法，关键技术是利用标记材料偶联抗体，使抗体显色，进而识别抗原物质。常见的显色型标记物有酶、胶体金以及乳胶微球。酶作为标记材料的技术虽然比较成熟，但酶受温度影响较大，稳定性差，产品有效期短；胶体金是目前商品化试纸条中使用最多的标记材料，但其信号方法成本高，无法用于精确检测；乳胶微球在液体中可以形成稳定的胶体，与胶体金相比，微球颗粒更大，可以节省抗体用量，灵敏度更高；同时可以进行大规模生产，成本更低；稳定性与灵敏度更优。因此，通过在表面携带不同基团的乳胶微球上与抗体实现共价结合形成结构稳定的复合物，以应用于疾病诊断和生物医药等领域是目前研究的热点。然而，乳胶微球在活化之前易发生聚沉，而在活化后pH值提高又容易发生水解，导致乳胶微球与抗体的偶联效率较低，难以满足乳胶微球标记物在临床免疫检测中的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是解决现有技术中的不足，提供一种羧基乳胶微球与抗体偶联方法，提高乳胶微球与抗体的偶联效率。为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，包括以下步骤：S1，将质量分数为4％羧基乳胶微球原液与活化缓冲液按体积比1:15-25充分混合，离心，弃上清，向沉淀中加入4倍所述羧基乳胶微球原液体积的活化缓冲液，再次混合，超声，至溶液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，得到微球悬液，将微球悬液于4℃保存备用；S2，将100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比0.8-1.2:5.5-6.5:65-75快速充分混合，反应30min，得到第一混合液；S3，对所述第一混合液进行超声，至所述第一混合液中的羧基乳胶微球处于单分散状态后，离心洗涤，得到沉淀液，向沉淀液中加入质量分数为10％的Tween-20混匀，得到活化微球液，将活化微球液于4℃保存备用，所述活化微球液中的Tween-20的质量分数为0.1-0.2％；S4，将0.1～1ug/μL的抗体溶液与所述活化微球液按体积比为3-4:1进行混合，偶联反应2h以上，得到微球-抗体标记物溶液；S5，向所述微球-抗体标记物溶液中加入1mol/L乙醇胺溶液，旋转混合均匀，得到第三混合液，所述第三混合液中乙醇胺的浓度为5～20mmol/L；S6，对所述第三混合液进行超声、离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀，向所述微球-抗体标记物沉淀中加入保存液重悬，即得到含有质量分数0.5％的羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液。进一步的，所述步骤S1之前还包括：将所述羧基乳胶微球液超声3-10min。进一步的，所述步骤S3中离心洗涤，得到沉淀液的具体操作包括步骤S301-302：S301，将超声后的第二混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的SDS溶液重悬，得到第一重悬液，所述SDS溶液的质量分数为0.005％；S302，将所述第一重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，加入与所述羧基乳胶微球原液体积一致的纯化水重悬沉淀，得到第二重悬液，超声所述第二重悬液至所述第二重悬液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，即得到所述沉淀液。进一步的，所述步骤S6离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀的具体操作包括步骤S601-602：S601，将超声后的第三混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，将沉淀用1mL的保存液重悬，得到第三重悬液；S602，将所述第三重悬液进行第二次离心，8000-12000rpm，10-20min，弃上清，即得到微球-抗体标记物沉淀。进一步的，所述步骤S6之后，还包括将所述羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液于4℃冷藏保存的步骤。进一步的，所述抗体溶液具体为抗体原液与抗体缓冲液配制而得，所述抗体缓冲液为100mmol/L的HEPES缓冲液或100mmol/L的PB缓冲液。进一步的，所述活化缓冲液的pH＝6，每1L的活化缓冲液中包括19-20gMES，0.001-1gSDS。进一步的，所述保存液pH＝8.5，所述保存液由0.5gBSA，0.5gTween-20和0.05gProClin300加入100mL10mmol/L的Tris-HCl缓冲液中配制而得。与现有技术相比，本专利技术所能达到的技术效果包括：(1)本专利技术所提供的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，在活化过程中加入表面活性剂SDS增强微球稳定性，用EDC和Sulfo-NHS活化时不贴壁聚沉，保证其单分散性，降低了超声处理频次；且SDS在乳胶微球的活化过程中不会与EDC发生反应，提高了微球的活化效率；活化过程中用Sulfo-NHS代替传统的NHS，保证活化后乳胶微球仍带负电荷，不发生凝集沉淀；(2)本专利技术所提供的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，活化后用SDS溶液洗涤羧基乳胶微球不会提高悬液的pH度，极大地避免了乳胶微球活化中间体被水解；偶联反应过程中Tween-20作为温和的表面活性剂可稳定活化后的乳胶微球，避免偶联后乳胶微球表面负电荷减少而聚沉，同时低浓度Tween-20对抗体活性无影响，提高乳胶微球的单分散性进而提高偶联效率。(3)本专利技术所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其保存液中的缓冲液以及0.5％BSA可保护偶联到乳胶微球上的抗体，防止其变性，低浓度Tween-20保证乳胶处于单分散状态，痕量ProClin300为防腐剂，该保存液配方可保证标记抗体后的乳胶微球在4℃条件下稳定存放3个月以上不发生聚沉，同时抗体活性几乎无降低。(4)本专利技术所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法适用于羧基乳胶微球与不同抗体的偶联，适用范围广，实现抗原物质的定性与定量检测，易于形成试纸条的规模化制备与生产。具体实施方式下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。还应当理解，在此本专利技术实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本专利技术实施例。如在本专利技术实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，将质量分数为4％羧基乳胶微球原液与活化缓冲液按体积比1:15-25充分混合，离心，弃上清，向沉淀中加入4倍所述羧基乳胶微球原液体积的活化缓冲液，再次混合，超声，至溶液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，得到微球悬液，将微球悬液于4℃保存备用；/nS2，将100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比0.8-1.2:5.5-6.5:65-75快速充分混合，反应30min，得到第一混合液；/nS3，对所述第一混合液进行超声，至所述第一混合液中的羧基乳胶微球处于单分散状态后，离心洗涤，得到沉淀液，向沉淀液中加入质量分数为10％的Tween-20混匀，得到活化微球液，将活化微球液于4℃保存备用，所述活化微球液中的Tween-20的质量分数为0.1-0.2％；/nS4，将0.1～1ug/μL的抗体溶液与所述活化微球液按体积比为3-4:1进行混合，偶联反应2h以上，得到微球-抗体标记物溶液；/nS5，向所述微球-抗体标记物溶液中加入1mol/L乙醇胺溶液，旋转混合均匀，得到第三混合液，所述第三混合液中乙醇胺的浓度为5～20mmol/L；/nS6，对所述第三混合液进行超声、离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀，向所述微球-抗体标记物沉淀中加入保存液重悬，即得到含有质量分数0.5％的羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液。/n...

【技术特征摘要】
1.一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将质量分数为4％羧基乳胶微球原液与活化缓冲液按体积比1:15-25充分混合，离心，弃上清，向沉淀中加入4倍所述羧基乳胶微球原液体积的活化缓冲液，再次混合，超声，至溶液中的羧基乳胶微球处于单分散状态，得到微球悬液，将微球悬液于4℃保存备用；
S2，将100g/L的EDC水溶液、100g/L的Sulfo-NHS水溶液以及所述微球悬液按体积比0.8-1.2:5.5-6.5:65-75快速充分混合，反应30min，得到第一混合液；
S3，对所述第一混合液进行超声，至所述第一混合液中的羧基乳胶微球处于单分散状态后，离心洗涤，得到沉淀液，向沉淀液中加入质量分数为10％的Tween-20混匀，得到活化微球液，将活化微球液于4℃保存备用，所述活化微球液中的Tween-20的质量分数为0.1-0.2％；
S4，将0.1～1ug/μL的抗体溶液与所述活化微球液按体积比为3-4:1进行混合，偶联反应2h以上，得到微球-抗体标记物溶液；
S5，向所述微球-抗体标记物溶液中加入1mol/L乙醇胺溶液，旋转混合均匀，得到第三混合液，所述第三混合液中乙醇胺的浓度为5～20mmol/L；
S6，对所述第三混合液进行超声、离心洗涤，得到微球-抗体标记物沉淀，向所述微球-抗体标记物沉淀中加入保存液重悬，即得到含有质量分数0.5％的羧基乳胶微球-抗体标记物重悬液。


2.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述步骤S1之前还包括：将所述羧基乳胶微球液超声3-10min。


3.如权利要求1所述的羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，其特征在于，所述步骤S3中离心洗涤，得到沉淀液的具体操作包括步骤S301-302：
S301，将超声后的第二混合液进行第一次离心，8000-12000rpm，10-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑招荣，柳秋月，梁灿丽，蔡佳龙，刘金超，
申请(专利权)人：深圳市瀚德标检生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44