【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表面结合寡核苷酸的化学裂解和脱保护的组合物和方法通过参考优先权申请的并入本申请要求2018年5月15日提交的美国临时申请号62/671,816、2019年1月3日提交的62/788,045的优先权，其每一个在此通过引用整体并入。电子格式的序列表本申请与电子序列表一起通过EFS-Web提交为ASCII文本文件。电子序列表提供为名为ILLINC363WOSEQLIST.txt的文件，创建并最后保存于2019年5月10日，大小为2,806字节。电子序列表中的信息通过引用整体并入本文。
技术介绍
本公开的实施方案涉及用于多核苷酸测序的模板的制备方法。特别地，本公开涉及通过化学裂解固定在固体载体上的双链多核苷酸的一个或多个第一链而将为测序制备的聚簇多核苷酸线性化，其在某些情况下通过在过渡金属络合物(例如钯络合物或镍络合物)存在下反应来进行。此外，本公开涉及固体载体上经修饰引物的化学介导的脱保护。各种核酸测序方法是本领域已知的。美国专利号5,302,509描述了一种用于测序多核苷酸模板的方法，其涉及...
【技术保护点】
1.一种将多个固定的双链多核苷酸线性化的方法，其包括：/n提供包含双链多核苷酸的固体载体，其中每个双链多核苷酸包含第一链和第二链，其中第一链和第二链各自在其5'端固定于固体载体，并且其中每个第一链包含能够通过过渡金属络合物进行化学裂解的第一裂解位点，其中过渡金属络合物是钯络合物或镍络合物；/n使双链多核苷酸与过渡金属络合物的水溶液接触，从而在第一裂解位点裂解一个或多个第一链，并产生一个或多个裂解的第一核酸和裂解的固定的第一链；以及，/n从固体载体上去除裂解的第一核酸。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180515 US 62/671,816;20190103 US 62/788,0451.一种将多个固定的双链多核苷酸线性化的方法，其包括：
提供包含双链多核苷酸的固体载体，其中每个双链多核苷酸包含第一链和第二链，其中第一链和第二链各自在其5'端固定于固体载体，并且其中每个第一链包含能够通过过渡金属络合物进行化学裂解的第一裂解位点，其中过渡金属络合物是钯络合物或镍络合物；
使双链多核苷酸与过渡金属络合物的水溶液接触，从而在第一裂解位点裂解一个或多个第一链，并产生一个或多个裂解的第一核酸和裂解的固定的第一链；以及，
从固体载体上去除裂解的第一核酸。
2.权利要求1的方法，其中每个第一链从固定于固体载体的第一延长引物延长。
3.权利要求2的方法，其中第一延长引物包含第一裂解位点。
4.权利要求2或3的方法，其中第一延长引物包含P5序列或经修饰的P5序列。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中第一裂解位点包含能够通过过渡金属络合物进行化学裂解的经修饰的核苷或核苷酸部分。
6.权利要求5的方法，其中经修饰的核苷或核苷酸部分包含烯丙基。
7.权利要求5或6的方法，其中第一裂解位点包含经修饰的核苷或核苷酸部分，所述部分具有式(II')的结构：
其中，碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶、或其衍生物。
8.权利要求5至7中任一项的方法，其中经修饰的核苷或核苷酸部分具有胸腺嘧啶碱基。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中过渡金属络合物是钯(0)络合物。
10.权利要求9的方法，其中钯(0)络合物为Pd(THP)2、Pd(THP)4、Pd(THM)4或其组合。
11.权利要求9的方法，其中钯(0)络合物是原位产生的。
12.权利要求11的方法，其中钯(0)络合物是通过将一种或多种钯(II)化合物与三(羟基丙基)膦(THP)混合而产生的，并且其中钯(II)化合物选自Na2PdCl4、(PdAllylCl)2、[PdAllyl(THP)]Cl和[PdAllyl(THP)2]Cl。
13.权利要求11的方法，其中钯(0)络合物是通过将Pd(PPh3)4与三(羟基丙基)膦混合而产生的。
14.权利要求1至8中任一项的方法，其中过渡金属络合物是镍(0)络合物。
15.权利要求14的方法，其中镍(0)络合物是由镍(II)化合物原位产生的。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中每个裂解的固定的第一链的3'端包含保护基。
17.权利要求16的方法，其中保护基是具有式(I)的结构的3'末端磷酸酯部分：
其中：
R1为-NH2、-OH、-NHC(O)ORa或-OCH2OSi(Rb)3；
Ra为C1-4烷基、叔丁基、烯丙基、苄基或9-芴基甲基；
每个Rb独立地选自C1-4烷基和苯基；并且
R2为H、C1-4烷基、任选取代的四氢呋喃、或核苷酸。
18.权利要求1至17中任一项的方法，其中每个第二链从固定于固体载体的第二延长引物延长，并且每个第二链包含第二裂解位点。
19.权利要求18的方法，其中第二延长引物包含第二裂解位点。
20.权利要求18或19的方法，其中第二裂解位点不能通过钯络合物或镍络合物进行化学裂解。
21.权利要求18至20的方法，其中第二延长引物包含P7核苷酸序列、或经修饰的P7核苷酸序列、或P17核苷酸序列。
22.权利要求18至21中任一项的方法，其中第二裂解位点通过选自化学裂解、光裂解、酶促裂解及其组合中的方法而裂解。
23.权利要求22的方法，其中第二裂解位点通过化学裂解而裂解，并且其中第二裂解位点包括二醇接头或偶氮苯接头。
24.权利要求23的方法，其中二醇接头包含式(VIII)的结构：
其中
r是2、3、4、5或6；并且
s是2、3、4、5或6。
25.权利要求24的方法，其中二醇接头可通过高碘酸盐裂解。
26.权利要求23的方法，其中偶氮苯接头包含式(X)的结构：
其中
R1为H、羟基或被保护的羟基；
R2为H、C1-6烷基或C1-6烷氧基；
每个R3和R4独立地为H、卤素、-C(O)OR5或-C(O)NHR6；
每个R5和R6独立地为H、C1-6烷基或C6-10芳基；
X为-C(O)-、-CH2-或-C(O)NH-；并且
每个m1、m2和m3独立地是1、2、3、4、5、或6。
27.权利要求26的方法，其中偶氮苯接头可以通过Na2S2O4裂解。
28.权利要求22的方法，其中第二裂解位点通过酶促裂解而裂解。
29.权利要求1至28中任一项的方法，其中双链多核苷酸通过共价键合固定于固体载体。
30.一种将多个固定的双链多核苷酸线性化的方法，其包括：
提供包含双链多核苷酸的固体载体，其中每个双链多核苷酸包含第一链和第二链，其中第一链和第二链在其5'端固定于固体载体，并且其中每个第一链包含第一裂解位点，并且每个第二链包含含有偶氮苯接头的第二裂解位点；
在第一裂解位点裂解一个或多个第一链，并产生一个或多个裂解的第一核酸和裂解的固定的第一链；
从固体载体上去除裂解的第一核酸；
对固定的第二链进行测序；
再合成与第二链互补的衍生第一链；以及
在第二裂解位点裂解一个或多个第二链，并产生一个或多个裂解的第二核酸和裂解的固定的第二链。
31.权利要求30的方法，其中每个第一链从固定于固体载体的第一延长引物延长，并且其中第一延长引物包含第一裂解位点。
32.权利要求30或31的方法，其中第一裂解位点通过选自化学裂解、光裂解、酶促裂解及其组合中的方法而裂解。
33.权利要求30至32中任一项的方法，其中每个第二链从固定于固体载体的第二延长引物延长，并且其中第二延长引物包含第二裂解位点。
34.权利要求30至33中任一项的方法，其中偶氮苯接头包含式(X)的结构：
其中
R1为H、羟基或被保护的羟基；
R2为H、C1-6烷基或C1-6烷氧基；
每个R3和R4独立地为H、卤素、-C(O)OR5或-C(O)NHR6；
每个R5和R6独立地为H、C1-6烷基或C6-10芳基；
X为-C(O)-、-CH2-或-C(O)NH-；并且
每个m1、m2和m3独立地是1、2、3、4、5、或6。
35.权利要求30至34中任一项的方法，其中偶氮苯接头通过Na2S2O4裂解。
36.权利要求30至35中任一项的方法，其中固定的第二链的测序包括连续掺入与固定的第二链互补的被标记的核苷酸并检测被标记的核苷酸。
37.权利要求30至36中任一项的方法，其中每个裂解的固定的第一链的3'端包含保护基。
38.权利要求37的方法，其中在再合成衍生第一链之前，将3'端裂解的固定的第一链的保护基脱保护。
39.权利要求30至38中任一项的方法，其进一步包括从固体载体上去除裂解的第二核酸，并对衍生第一链进行测序。
40.一种从寡核苷酸上去除3'端保护基的方法，其包括：
提供固体载体，其包含在其5'端固定在所述固体载体上的多个寡核苷酸，其中寡核苷酸各自包含具有式(I)的结构的3'端保护基；和
使寡核苷酸与脱保护试剂接触，从而裂解3'端保护基，以产生各自具有游离3'端羟基的寡核苷酸；
其中，
R1是-NH2、-OH、-NHC(O)ORa或-OCH2OSi(Rb)3；
Ra为C1-4烷基、叔丁基、烯丙基...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓琳，R·史密斯，P·希埃，J·M·贝耶尔勒，W·N·乔治，E·J·劳伦斯，毛捷，刘小海，
申请(专利权)人：伊鲁米纳公司，伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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