一种在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯的方法技术

本发明专利技术利用脂肪酶界面激活特性，发明专利技术了一种在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯的方法，具体合成方法如下：首先构建反胶束酶体系，即在2‑乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）的异辛烷溶液中加入非固定水溶性脂肪酶缓冲水溶液（50 mmol/mL磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠，pH 6.5~8），聚能超声获得澄清反胶束酶体系，其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3~8:200~600:20~30，再将50~100 mmol/mL植物甾醇和2~4倍植物甾醇摩尔质量的C12~C18脂肪酸加入反胶束酶体系中，在酶载量为总底物的1.5~3%、反应温度为35~55°C的条件下反应3~6 h，过程中辅以发散超声作用，经HPLC法测得酯化产物得率为85.79~92.82%，最终通过溶剂结晶法纯化产物，经HPLC法测得纯度98.56~99.43%。本发明专利技术具备高效率高产率生产植物甾醇酯的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯的方法
本专利技术属于粮油加工领域，具体涉及一种在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯的方法。
技术介绍
植物甾醇是一类化学结构与胆固醇相似的三萜烯类天然产物，具体种类超过100种，其中最为常见的4种为β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇及菜油甾醇，早在1950s年代，植物甾醇即在动物和人体上均被试验证明可显著降低血胆固醇，进而降低患心血管疾病的风险，但由于其油溶性和水溶性均很差，难以被人体直接摄入利用，因此如今主要是通过把植物甾醇酯化来增大它的溶解度，增加20~40％的生物利用率。植物甾醇酯的合成方法可以根据催化剂不同分为化学合成和酶法合成。采用酸碱催化剂将酰基供体和植物甾醇转化为植物甾醇酯的方法称为化学法。酸碱溶液催化是最传统也是应用最早的方法，其操作简单，产率可观。在更为近代的非均相催化理论的指导下，金属氧化物催化、胶束催化、离子液体催化合成植物甾醇酯的研究亦得以开展，他们反应条件更加温和，后续分离容易，催化剂重复率高。化学催化简单易行，但是能耗高，污染严重，不符合现代科学发展观的理念。采用脂肪酶将酰基供体和植物甾醇转化为植物甾醇酯的方法称为酶法，酶法催化反应条件更加温和、产物选择性高并且绿色环保，是现代植物甾醇酯合成的主要方法。常见的脂肪酶如Candidarugosa脂肪酶、Rhizopusdelemar脂肪酶、Aspergillusoryzae脂肪酶等，均被证明具有优秀的酯化植物甾醇的能力，同时，脂肪酶反应媒介广泛，在水溶液、有机溶剂、超临界CO2流体等中均可进行有效的酯化反应。然而随着研究的深入，酶法合成植物甾醇酯也暴露出较多问题，其中最主要的问题就是脂肪酶催化活性低，需要长时间反应才可实现高产率。研究表明脂肪酶具有界面活化现象，由此可见，若能提供一个稳定的油水界面作为酯化反应场所，可能可实现比传统媒介中更高的酯化效率。反胶束是一种自发形成的纳米尺度的聚集体，是一种透明的、热力学稳定的W/O体系，由浓度超过临界胶束浓度的表面活性剂形成，其中表面活性剂极性基团朝内排列形成一个极性核，当该极性核溶解酶液后，该体系构成反胶束酶体系。反胶束酶体系具有较大的油水界面，且由于表面活性剂的辅助作用，界面稳定性良好，脂肪酶在该体系中被界面激活，加之酶溶解在极性核后呈分子水平扩散，降低扩散阻力，增大了与底物的接触机会，以上优势均可提高产物得率，因此该体系在酯化合成方面具有很好的应用前景。已有的反胶束酶体系的制备方法较为简单，将表面活性剂溶液和酶液混合并充分震荡至澄清即可，但该法制备的反胶束体系存在液滴大小不均匀，稳定性较差等问题。一方面，稳定性差使得体系不可长时间利用；另一方面，反胶束中的液滴大小和脂肪酶的尺寸之间的关系是决定脂肪酶在反胶束体系中活性的重要因素之一，故由于液滴大小不均匀性，酶活性提高不完全且结果重复性差。超声波是一种频率高于20kHz的声波，其机械效应可促成液体的乳化、凝胶的液化和固体的分散，研究表明，超声波辅助制备的乳液具有较高的稳定性且液滴均匀，考虑到反胶束体系是一种类似于乳液的体系，故超声波可能对反胶束酶体系具有相似的影响。除此之外，超声波的空化作用还可起到搅拌作用，使底物和酶充分接触，最终提高得率。因此，本法将反胶束体系应用到脂肪酶催化植物甾醇酯化反应中，并在反胶束体系制备和反应物合成过程中均辅以超声作用，在较短时间内合成高产率产品，具有高效率高产率生产植物甾醇酯的优点。
技术实现思路
本专利技术公开了一种在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯的方法，以克服现有技术在合成植物甾醇酯上的不足，所述反胶束酶体系由脂肪酶缓冲水溶液和表面活性剂溶液混合而成，其中表面活性剂溶液由2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）和异辛烷组成，脂肪酶为非固定化水溶性脂肪酶，缓冲水溶液为50mol/mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（PBS），植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇，脂肪酸为C12~C18脂肪酸，所述合成产物为植物甾醇脂肪酸酯。本专利技术包括以下几个步骤：（1）均一化反胶束酶体系的构建AOT异辛烷溶液和非固定化水溶性脂肪酶缓冲水溶液（50mmol/mLPBS，pH6.5~8）混合，其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3~8:200~600:20~30，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为20~30kHz，功率为200~400W，超声温度为35~55°C，超声总时间为35~56s，超声方式为“超声5s-停2s”。（2）在反胶束酶体系合成植物甾醇酯将50~100mmol/mL植物甾醇和2~4倍植物甾醇摩尔质量的C12~C18脂肪酸加入反胶束酶体系中，在酶载量为总底物的1.5~3%、反应温度为35~55°C的条件下反应3~6h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为30~40kHz，功率为200~400W，超声方式为“超声10s-停20s”，反应结束后经HPLC法测得酯化产物得率为85.79~92.82%。（3）利用溶剂结晶法得纯化产物反应结束，将反应液中的溶剂先于旋转蒸发仪中浓缩，真空度为0.01~0.02MPa，温度为40~50°C，再将其与正己烷/乙醇溶液（v/v=1/0.5~2）以料液比1:8~10（料以起始植物甾醇量的20%计算）的比例进行混合，置于40~50℃水浴锅中，边搅拌边加入1mol/LNaHCO3溶液中和过量脂肪酸，静置分层后取上清液，于旋转蒸发仪中浓缩，真空度为0.01~0.02MPa，温度为30~40°C。将上述第一次纯化后的粗产物以料液比1:8~10的比例加入无水乙醇，置于40~50℃水浴锅中，搅拌洗涤1h，抽滤后取沉淀，最后50°C真空干燥6h除水，得植物甾醇脂肪酸酯产品，经HPLC法测得纯度为98.56~99.43%。本专利技术的有益效果是：（1）采用聚能超声辅助制备含有脂肪酶的水/AOT/异辛烷反胶束酶体系，再采用发散超声辅助促进酶法催化合成植物甾醇脂肪酸酯，具有生成条件温和，酯化率高，产量高的优点。（2）采用溶剂结晶法纯化产物，操作简单，纯度高，可大批量制备后进一步用于动物实验，研究其降胆固醇动能，进而研究其对人体心血管疾病的影响。（3）本方法描述的植物甾醇脂肪酸酯合成方法简单，易于操作，可以适用于各类植物甾醇脂肪酸酯的合成。具体实施方式实施例1将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量非固定化水溶性Candidarugosa脂肪酶缓冲水溶液（50mol/mLPBS，pH7.5），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]=3:375:25，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为25kHz，功率为300W，超声温度为45°C，超声总时间为42s，超声方式为“超声5s-停2s”。然后加入50mol/Lβ-谷甾醇和3.5倍摩尔质量的月桂酸，在酶载量为总底物的1.6%、反应温度为45°C的条件下反应6h，过程中辅以发散超声作用，超本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯的方法，其特征是：/n（1）将脂肪酶缓冲水溶液和表面活性剂溶液混合，通过聚能超声，构成均一的反胶束酶体系；/n（2）往体系中加入反应底物植物甾醇和脂肪酸，辅以发散超声作用，反应得到植物甾醇酯；/n（3）利用溶剂结晶法得纯化产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯的方法，其特征是：
（1）将脂肪酶缓冲水溶液和表面活性剂溶液混合，通过聚能超声，构成均一的反胶束酶体系；
（2）往体系中加入反应底物植物甾醇和脂肪酸，辅以发散超声作用，反应得到植物甾醇酯；
（3）利用溶剂结晶法得纯化产物。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述构成反胶束酶体系的表面活性剂溶液由2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）和异辛烷组成，脂肪酶为非固定化水溶性脂肪酶，缓冲水溶液为50mmol/mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（PBS），植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇，脂肪酸为C12~C18脂肪酸，目标合成产物为植物甾醇脂肪酸酯。


3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反胶束酶体系构建方法是将AOT异辛烷溶液和非固定化水溶性脂肪酶缓冲水溶液（50mmol/mLPBS，pH6.5~8）混合，其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3~8:200~600:20~30，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为20~30kHz，功率为200~400W，超声温度为35~55°C，超声总时间为35~56s，超声方式为“超声5s-停2s”。


4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述酯化反应步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓泽元，张兵，陈孙妮，李静，李红艳，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36