采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法技术

本发明专利技术属于甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种采用生长细胞生物发酵麦角固醇制备中间体的方法。本发明专利技术包括以下步骤：(1)3位保护；(2)生长细胞转化；(3)提取；(4)水解；(5)精制。本发明专利技术的制备方法成本较低，路线更短，省掉了许多反应步骤和后处理步骤，反应路线的缩短也有利于反应收率的提高，减少中间损耗。本发明专利技术采取3位羟基保护的步骤在前，生长细胞生物发酵反应在后，直接加大了发酵底物在发酵液中的溶解度，有利于发酵的进行，可提高产物的收率，减少杂质的产生。本发明专利技术的制备方法还能减少化学试剂的使用，有利于环境保护。

Preparation of intermediates from ergosterol etherification by growth cell fermentation

【技术实现步骤摘要】
采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法
本专利技术属于甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法。
技术介绍
中间体孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇的结构式如下式所示，该产品为甾体合成中重要的中间体，传统的制备方法中是使用3位酮基的类似结构，并使用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基，但使用化学方法得到的产品常常带有一定量的3位α羟基异构体，且需要通过多步化学反应来完成，其中需用到多种价格贵且不利于环保的试剂，成本较高，同时收率低，产品质量差。菌株Mycobacteriumsp.B-NRRL3683记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术的目的是提供采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇的方法，能够解决该中间体合成过程中步骤复杂、易产生3位α羟基异构体杂质，且成本较高、收率较低的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇的方法，包括以下步骤：(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将麦角固醇的3位羟基进行保护，得到麦角固醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；(2)生长细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)B-NRRL3683诱变菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对步骤(1)得到的所述麦角固醇醚化物进行发酵转化；(3)提取：转化结束后对步骤(2)所得的发酵产物进行提取，得到固体产物；(4)水解：将步骤(3)所得的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌后抽滤，合并滤液，减压浓缩后加入盐酸进行水解；(5)精制：将步骤(4)所得的水解产物进行精制提纯。进一步地，本专利技术的甲缩醛作为反应溶剂和反应剂，只要能保证反应的进行，反应剂的量没有特别要求，优选的甲缩醛与麦角固醇的质量比为3-20:1。为了推动反应向正向进行，需要除去反应产生的甲醇和体系中少量的水分，因此需要加入催化剂五氧化二磷，五氧化二磷吸收甲醇或水分变成磷酸酯或磷酸，在甲缩醛中溶解度较低，呈油状物，可通过加入助滤剂吸附后过滤除去，助滤剂优选硅藻土。过滤剂和催化剂的加入量以能达到目的为标准，经过研究人员常规的实验即可得到，本专利技术优选的过滤剂加入量为麦角固醇重量的1倍，催化剂的加入量为麦角固醇重量的0.5倍。进一步地，所述步骤(2)中B-NRRL3683诱变菌种的制备方法为：a.以分枝杆菌B-NRRL3683为出发菌种，在加入2％质量比琼脂的M1固体培养基中斜面培养，将斜面种子接种于M1液体种子培养基中活化，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；取活化好的一级种子按体积比10％接入新的M1液体种子培养基中进行二级种子培养，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；b.将生长好的二级种子10000rpm离心5min，收集菌体，用pH＝6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次，再用pH＝6.0的无菌磷酸钾缓冲溶液制成菌悬液，并将浓度稀释至108-109个/ml；c.取上述菌悬液2ml，0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml，0.2mol/LpH＝6.0的磷酸钾缓冲液2ml，加入离心管中充分混匀，置于30℃水浴避光振荡处理25-35min，优选30min，离心收集菌体，用PBS冲洗3次，向离心管中加入5ml无菌生理盐水，摇匀后取出一定的菌悬液，用生理盐水稀释，取100ul上述稀释菌悬液涂布于固体平板培养基上，30℃避光培养，挑选生长良好的突变菌株单菌落进行麦角固醇发酵，并检测孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇产量，得到能产生该中间体的目标诱变菌种；进一步地，所述步骤(2)中B-NRRL3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤：(1)斜面培养：培养基配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，琼脂2％，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，30℃培养4-5d；(2)一级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h；(3)二级种子培养：培养基配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0，121℃灭菌30min；将一级种子液按体积比10％接种至二级种子培养基，接种后，于30℃，200rpm摇床培养48h。在本专利技术的一些具体实施例中，所述步骤(2)中转化培养基的配方包括以质量百分比计的以下成分：玉米浆1-6％，硝酸钠0.1-0.6％，磷酸氢二铵0.01-0.08％，PPE0.1-0.2％，麦角固醇醚化物1-10％，羟丙基环糊精0.1-5％，pH＝7.5-8.0。进一步地，若步骤(2)中使用上述转化培养基，则步骤(3)中的提取方法具体为：转化结束后将发酵产物静置2h分层，上层菌液加入氯仿常温搅拌萃取30min，静置，分出下层氯仿层，减压浓缩至干，下层固体抽滤干，收集滤饼，滤液用氯仿萃取，合并得固体产物。优选地，上述转化培养基中的麦角固醇醚化物粉碎至200目。在本专利技术的另一些具体实施例中，所述步骤(2)中转化培养基的配方包括以质量百分比计的以下成分：玉米浆1-6％，硝酸钠0.1-0.6％，磷酸氢二铵0.01-0.08％，PPE0.1-0.2％，麦角固醇醚化物1-10％，大豆油6-16％，pH＝7.5-8.0。进一步地，若步骤(2)中使用上述转化培养基，则步骤(3)中的提取方法具体为：转化结束后将发酵产物加热到80℃，静置1h分层，上层油相降至常温后使用甲醇萃取3次，每次使用3-6倍体积的甲醇；提取完毕，减压浓缩后加水，再次减压浓缩，带干水分后抽滤，得固体产物。进一步地，所述步骤(2)中的生长细胞转化具体为：按所述配方配制转化培养基，121℃灭菌30min，冷却至室温，于无菌条件下接种1-20％B-NRRL3683诱变菌种二级种子液，于28-32℃，空气流量0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa条件下转化。步骤(4)的水解反应为常规实验，其过程可为：将抽滤及减压浓缩得到的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌1h，抽滤，合并滤液，45℃减压浓缩至无馏分，加入2-5倍体积的质量分数为5-20％的盐酸，升温至60℃，水解1-2h。步骤(5)的精制提纯方法为常规实验。精制提纯的方法可为：将水解得到的滤饼70℃烘干，使用10倍甲醇(相对于最初麦角固醇的投量，单位g/ml或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述中间体为孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇，所述制备方法包括以下步骤：/n(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将麦角固醇的3位羟基进行保护，得到麦角固醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；/n(2)生长细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对步骤(1)得到的所述麦角固醇醚化物进行发酵转化；所述B-NRRL 3683诱变菌种的制备方法为：以分枝杆菌B-NRRL 3683为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行麦角固醇发酵，并检测孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇产量，得到能产生该中间体的目标诱变菌种；/n(3)提取：转化结束后对步骤(2)所得的发酵产物进行提取，得到固体产物；/n(4)水解：将步骤(3)所得的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌后抽滤，合并滤液，减压浓缩后加入盐酸进行水解；/n(5)精制：将步骤(4)所得的水解产物进行精制提纯。/n...

【技术特征摘要】
1.采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述中间体为孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇，所述制备方法包括以下步骤：
(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将麦角固醇的3位羟基进行保护，得到麦角固醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；
(2)生长细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)B-NRRL3683诱变菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对步骤(1)得到的所述麦角固醇醚化物进行发酵转化；所述B-NRRL3683诱变菌种的制备方法为：以分枝杆菌B-NRRL3683为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行麦角固醇发酵，并检测孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇产量，得到能产生该中间体的目标诱变菌种；
(3)提取：转化结束后对步骤(2)所得的发酵产物进行提取，得到固体产物；
(4)水解：将步骤(3)所得的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌后抽滤，合并滤液，减压浓缩后加入盐酸进行水解；
(5)精制：将步骤(4)所得的水解产物进行精制提纯。


2.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲缩醛与麦角固醇的质量比为3-20:1。


3.根据权利要求1所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL3683诱变菌种的制备方法具体为：
a.以分枝杆菌B-NRRL3683为出发菌种，在加入2％质量比琼脂的M1固体培养基中斜面培养，将斜面种子接种于M1液体种子培养基中活化，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；取活化好的一级种子按体积比10％接入新的M1液体种子培养基中进行二级种子培养，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；
b.将生长好的二级种子10000rpm离心5min，收集菌体，用pH＝6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次，再用pH＝6.0的无菌磷酸钾缓冲溶液制成菌悬液，并将浓度稀释至108-109个/ml；
c.取上述菌悬液2ml，0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml，0.2mol/LpH＝6.0的磷酸钾缓冲液2ml，加入离心管中充分混匀，置于30℃水浴避光振荡处理25-35min，离心收集菌体，用PBS冲洗3次，向离心管中加入5ml无菌生理盐水，摇匀后取出一定的菌悬液，用生理盐水稀释，取100ul上述稀释菌悬液涂布于固体平板培养基上，30℃避光培养，挑选生长良好的突变菌株单菌落进行麦角固醇发酵，并检测孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇产量，得到能产生该中间体的目标诱变菌种。


4.根据权利要求1或3所述的采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中B-NRRL3683诱变菌种种子培养的方法包括以下步骤：
(1)斜面培养：...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐艳平，刘喜荣，孟浩，曾春玲，杨芳，
申请(专利权)人：湖南新合新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43