一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法技术

本发明专利技术提供了一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，所述发酵菌株为SEB12，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.18216，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明专利技术还提供了一种上述耐乙醇耐高糖的发酵菌株的构建方法。在乙醇葡萄糖共发酵、高糖或高温情况下，本发明专利技术的发酵菌株SEB12的乙醇发酵速率相对于出发菌株较高，说明所述菌株具有耐高糖、耐高乙醇的优势，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法
本专利技术涉及发酵菌株领域，具体涉及一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法。
技术介绍
随着环境污染的加剧和全球化石能源的日渐枯竭，开发新的清洁能源势不容缓，生物乙醇作为一种新型的可再生能源，日益成为研究热点。以非粮生物质生产燃料乙醇替代化石燃料，可有效解决化石燃料带来的能源危机和环境污染，为了降低成本，则需提高终点乙醇浓度，采用超高浓度(VHG)乙醇发酵(培养基含糖量大于250g/L以期获得15％以上的乙醇)可以提高终点乙醇浓度从而提高生产设备使用率、节省精馏能耗和工业用水是一种节能减排的发酵技术。然而在VHG发酵过程中，酿酒酵母往往会受到各种因素胁迫，其中发酵初期高浓度底物的渗透作用以及终产物乙醇对菌株的毒性作用是制约酿酒酵母生产乙醇的重要瓶颈，尽管目前已有一些关于酿酒酵母对乙醇或高糖耐受能力的报道，但大多数研究以实验室酵母为出发菌株，且多针对单一物质，对多耐受性酿酒酵母的研究极少。而这些研究主要集中在酿酒酵母如何抵御乙醇毒性或高渗条件，但对于如何同时构建既耐受乙醇又耐受高糖的工业菌株尚不明确。由于在实际VHG发酵过程中，酿酒酵母会受到多种胁迫，因此，如何提高菌株在发酵初期的高糖耐受性和发酵末期的乙醇耐受性是实现非粮生物质能源转化的关键瓶颈。选育同时具有耐受高糖和乙醇特性的工业菌株，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法，以耐高温工业菌株为出发菌株，拟通过常压室温等离子体(ARTP)技术获得耐乙醇、耐高糖突变菌株，并结合基因组重排等技术使突变菌株随机杂交，最终通过TTC显色反应、杜氏导管、摇瓶发酵等方法对突变酵母菌株进行筛选，获得一株高糖和乙醇耐受能力较强的突变菌SEB12。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面提供了一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，所述发酵菌株为SEB12，所述发酵菌株分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，其保藏编号为CGMCCNo.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术的第二方面提供了一种上述耐乙醇耐高糖的发酵菌株的构建方法，其包括以下步骤：步骤1，选取出发菌株：SEB1和IR-2，将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得絮凝性融合子RHZ-1；步骤2，挑选一环RHZ-1菌株培养，再诱导其突变；步骤3，TTC初筛和杜氏导管复筛，筛选出在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行三角瓶发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株；步骤4，经过三轮基因组重排和步骤3的筛选方法获得耐受性能优良的突变菌株。进一步地，步骤2的诱变菌株突变的方法为等离子体照射。进一步地，等离子照射时间为50-70s。进一步地，等离子照射时间为60s。进一步地，步骤2的菌株培养至对数生长期与稳定期之间的过渡期。进一步地，步骤3的具体实验步骤包括：a.将经过ARTP诱变后的菌液涂布于2％YPD平板上培养后，倾倒在TTC上层培养基进行染色，避光培养0.5～1h，选择红色较深的菌株保存(颜色越深，其代谢越旺盛)；b.通过杜氏导管法，取无水乙醇对应加入到内含杜氏管的YPD培养基中，混匀，接入各突变酵母静置培养，观察产气情况；c.配制含葡萄糖的内含杜氏管的YPD培养基，接入各突变酵母，静置培养，观察产气情况；d.选择在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株进行下一步基因组重排。进一步地，步骤4的具体实验步骤包括：a.取活化后的突变菌株，接种于100mL的YPD液体培养基中，在30℃，180rpm条件下培养约11h至对数期，5000rpm离心30s去上清收集菌体，用无菌水洗涤三次后，接种于100mLYPK预产孢培养基中，28℃，180rpm条件下培养12h，5000rpm离心30s去上清收集菌体，无菌水洗涤三次后，将菌体重悬于100mL的高效液体生孢培养基中，28℃，180rpm条件下培养5d。b.5000rpm离心30s去上清收集生孢后的细胞，用软化缓冲液重悬细胞使其最终浓度(OD600)为5，30℃条件下培养10min后，5000pm离心30s去上清收集菌体，用原生质体缓冲溶液重悬细胞使其最终浓度(OD600)为25。c.加入浓度为3％的蜗牛酶使其最终浓度(OD600)为14.4，30℃条件下反应30min后，5000rpm离心30s去上清收集菌体，用等量的0.5％(v/v)的TritonX-100洗涤一次后，再用0.5％(v/v)的TritonX-100重悬使孢子反应液为总体积的1/4。d.震荡该体系，使子囊壁充分破裂释放出孢子。e.将孢子用无菌水洗涤三次后重新接入100mLYPD液体培养基中，30℃，100rpm条件下培养24h使孢子进行充分接合形成二倍体菌株，将所得菌液涂布于含乙醇的YPD平板上，待菌落长起后，通过步骤3的方法进行筛选，最后通过三角瓶发酵选择性能进一步提升的突变菌株进行第二轮基因组重排，重排后的菌株再进行筛选，以此往复，通过三轮基因组重排，获得耐受性能优良的突变菌株SEB12。进一步地，步骤d中的震荡方法采用的是超声波，震荡至视野中无二倍体细胞时，终止超声破碎。最后，本专利技术还提供了一种耐乙醇耐高糖的发酵菌株SEB12在非粮生物质乙醇化工业化生产的应用。与现有技术相比，本专利技术采用上述技术方案具有以下有益效果：本专利技术所提供的一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及其构建方法，提高了乙醇收率，对实现非粮生物质乙醇化工业化生产具有重要意义。附图说明本专利技术的公开的一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株为SEB12，其已进行保藏，分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，其保藏编号为CGMCCNo.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。图1是本专利技术一实施例中的出发菌株RHZ-1和突变菌株在乙醇葡萄糖共发酵的情况下乙醇含量和葡萄糖含量变化的对比图；图2是本专利技术一实施例中的出发菌株RHZ-1和突变菌株在高糖条件下乙醇含量和葡萄糖含量变化的对比图；图3是本专利技术一实施例中的出发菌株RHZ-1和突变菌株在高温条件下乙醇含量和葡萄糖含量变化的对比图。具体实施方式本专利技术涉及一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法。下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。实施例1本实施例为发酵菌株SEB12的构建方法，其包括如下步骤：(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，其特征在于，所述发酵菌株为SEB12，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，其保藏编号为CGMCC No.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。/n

【技术特征摘要】
1.一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株，其特征在于，所述发酵菌株为SEB12，分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，其保藏编号为CGMCCNo.18216，保藏日期为2019年07月12日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。


2.一种构建如权利要求1所述的耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，选取出发菌株：SEB1和IR-2，将SEB1和IR-2产生的孢子通过原生质体融合获得絮凝性融合子RHZ-1；
步骤2，挑选一环RHZ-1菌株培养，再诱导其突变；
步骤3，TTC初筛和杜氏导管复筛，筛选出在乙醇和高糖条件下均产气较快的菌株进行发酵，选择产乙醇量有所提升的菌株；
步骤4，经过三轮基因组重排和步骤3的筛选方法，获得耐受性能优良的突变菌株。


3.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤2的诱变菌株突变的方法为等离子体照射。


4.根据权利要求3所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，所述的等离子照射时间为50-70s。


5.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤2的菌株培养至对数生长期与稳定期之间的过渡期。


6.根据权利要求2所述的构建耐乙醇耐高糖的发酵菌株的方法，其特征在于，步骤3的具体实验步骤包括：
a.将经过ARTP诱变后的菌液涂布于2％YPD平板上培养后，倾倒在TTC上层培养基进行染色，避光培养0.5～1h，选择红色较深的菌株保存；
b.通过杜氏导管法，取无水乙醇对应加入到内含杜氏管的YPD培养基中，混匀，接入各突变酵母静置培养，观察产气情况；
c.配制含葡萄糖的内...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤岳琴，缪晡，王莉，陈栋，李勇，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中石化上海工程有限公司，四川大学，
类型：发明
国别省市：北京;11