间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法技术

本发明专利技术提供一种间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法，涉及细胞生物学技术领域。该间充质干细胞冻存液，包括以下工作浓度的组分：间充质干细胞培养上清液25～35mL/100mL，甘油4～6mL/100mL，聚乙烯吡咯烷酮4～6g/100mL，聚乙烯醇0.5～1.5g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，羟基磷灰石纳米颗粒1～2.5g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL，血清替代物8～12mL/100mL；所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。本发明专利技术的冻存液能有效减少细胞在冻存和复苏过程中受到的损伤，提高复苏后细胞活性。

MSCs cryopreservation solution, cryopreservation method, preservation kit and resuscitation method

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法
本专利技术涉及细胞生物学
，特别是涉及一种间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法。
技术介绍
冷冻保护液(Cryoprotectant)是指可以保护细胞在极低温的环境中免受冻伤的物质，也称为细胞冻存液。在细胞悬液中加入冷冻保护剂可以保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合反应，弱化水的结晶，使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。根据是否可以穿透细胞膜，冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多为小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内，该类保护剂主要有二甲基亚砜，甘油，乙二醇等，其保护机制是在细胞悬液凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中的电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时细胞内水分不会过多外渗，避免细胞过度脱水皱缩，使用该类冷冻保护剂时，需要预冷一定时间，在细胞内外达到平衡以充分保护。非渗透性冷冻保护剂一般是大分子物质，不能渗透到细胞内，该类保护剂主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，蔗糖，聚乙二醇等，其保护机制是可以与同溶液中的水分子有限结合，降低溶液中自由水的含量，使得冰点降低，减少冰晶的形成。目前，间充质干细胞一般采用含10％DMSO的血清冻存液进行冻存。但是，该细胞冻存保护液中通常采用动物血清，会产生异种生物来源的外源污染，DMSO含量较高，细胞毒性大，这种细胞冻存保护液不能在临床上使用。而且，一般的细胞复苏过程，容易受热不均匀，发生二次结晶的现象，对细胞的损伤较大。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种间充质干细胞冻存液，能有效减少细胞在冻存和复苏过程中受到的损伤，提高复苏后细胞活性。一种间充质干细胞冻存液，包括以下工作浓度的组分：所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。上述间充质干细胞冻存液，不含外源血清和有机溶剂，避免外源蛋白污染，且不会对细胞产生毒害作用，羟基磷灰石(HA)纳米颗粒能有效减少冰晶形成，防止温度传导不均匀以及尖锐冰晶形成损伤细胞，在此基础上，还联合使用了全反式维甲酸和抗坏血酸，能有效地保护细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失。间充质干细胞培养上清液中含有丰富的生长因子，有利于维持间充质干细胞的活性。在其中一个实施例中，所述羟基磷灰石纳米颗粒的工作浓度为1.8～2.2g/100mL。该浓度的HA纳米颗粒的冻存液对细胞保护效果更佳。在其中一个实施例中，所述间充质干细胞冻存液的基底液为间充质干细胞选择性培养基。在其中一个实施例中，所述间充质干细胞选择性培养基为干细胞无血清培养基。优选地，可以选择友康公司的干细胞无血清培养基作为间充质干细胞选择性培养基。本专利技术一方面还包括一种间充质干细胞冻存方法，包括以下步骤：消化：将培养汇合度为75％～85％的间充质干细胞取出，清洗，消化，离心，保留沉淀，加入上述间充质干细胞冻存液，重悬得细胞悬液，细胞液浓度为4.5～5.5×106个/mL；冻存：使用程序降温仪将上述细胞悬液降温至-80℃，放置于液氮保存。以上方法采用本专利技术的间充质干细胞冻存液对细胞进行冻存，冻存细胞密度合理，冻存降温时温度传导均匀，不易产生冰晶，有效减少对细胞的伤害，提高复苏后细胞的活性，而且，由于不含外源血清和有害物质，复苏后的细胞可以应用于临床。在其中一个实施例中，所述细胞液浓度为5×106个/mL。在其中一个实施例中，所述冻存步骤中，降温在程序降温仪中进行。使用程序降温，减少细胞冻存的时冰晶的伤害，促进玻璃化的形成，减少细胞复苏后吸水胀破的风险。本专利技术一方面还提供一种间充质干细胞的保存试剂盒，包括复苏液和上述间充质干细胞冻存液。采用该保存试剂盒的冻存液和复苏液能，有效保护细胞，维持细胞活性。在其中一个实施例中，所述复苏液包括以下工作浓度的组分：所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。上述复苏液中含有高浓度的葡萄糖，随着葡萄糖的消耗，细胞内渗透压回归到正常水平，有效防止细胞胀破。在其中一个实施例中，所述复苏液的基底液为无血清培养基。本专利技术一方面还提供一种间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：解冻：取采用上述的间充质干细胞冻存液进行冻存的细胞，放置于37±0.5℃下解冻；离心：向解冻的细胞液中加入上述复苏液，离心，保留沉淀，加入复苏液重悬，接种，培养。上述复苏方法，首先采用了本专利技术的间充质干细胞冻存液进行冻存，然后采用了本专利技术的复苏液进行复苏，减少细胞吸水涨破的风险，保证细胞活性。在其中一个实施例中，所述离心步骤具体为：向解冻的细胞液中加入解冻后细胞液4～6倍体积的间充质干细胞选择性培养基，300g离心4～6min，保留沉淀，加入复苏液重悬，接种至培养瓶，放置于培养箱中培养。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的间充质干细胞冻存液，不含外源血清和有机溶剂，避免外源蛋白污染，且不会对细胞产生毒害作用，羟基磷灰石纳米颗粒能有效减少冰晶形成，防止温度传导不均匀以及尖锐冰晶形成损伤细胞，在此基础上，还联合使用了全反式维甲酸和抗坏血酸，能有效地保护细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失。本专利技术的冻存方法，采用本专利技术的间充质干细胞冻存液对细胞进行冻存，冻存细胞密度合理，冻存降温时温度传导均匀，不易产生冰晶，有效减少对细胞的伤害，提高复苏后细胞的活性，而且，由于不含外源血清和有害物质，复苏后的细胞可以应用于临床。本专利技术的保存试剂盒，在细胞冻存和复苏过程中，能有效保护细胞，维持细胞活性。本专利技术的复苏方法，采用了本专利技术的间充质干细胞冻存液进行冻存，并采用本专利技术的复苏液进行复苏，减少细胞吸水涨破的风险，保证细胞活性。附图说明图1为实施例2中间充质干细胞细胞复苏后细胞的生长情况图；图2为对比例1间充质干细胞细胞复苏后细胞的生长情况图；图3为实施例2所得细胞诱导分化成脂肪情况图；图4为对比例1所得细胞诱导分化成脂肪情况图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，以下将给出较佳实施例对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括以下工作浓度的组分：/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括以下工作浓度的组分：



所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。


2.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述羟基磷灰石纳米颗粒的工作浓度为1.8～2.2g/100mL。


3.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液的基底液为间充质干细胞选择性培养基。


4.根据权利要求3所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞选择性培养基为干细胞无血清培养基。


5.一种间充质干细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
消化：将培养汇合度为75％～85％的间充质干细胞取出，清洗，消化，离心，保留沉淀，加入权利要求1～3任一项所述的间充质干细胞冻存液，重悬得细胞悬液，细胞液浓度为4.5～5.5×106个/mL；
冻存：使用程序降温仪将上述细胞悬液降温至-80℃，放置于液氮保存。

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【专利技术属性】
技术研发人员：孙灿兴，李静静，赵蓝，刘小翠，江嘉豪，
申请(专利权)人：广东唯泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44